犬乳腺上皮细胞的分离鉴定及培养方法优化

冯子建 孙 娜 郝志立 孙盼盼 张 华 范阔海 尹 伟 杨惠珍 钟 佳 张振彪 王建中 孙耀贵 李宏全*

(1.山西农业大学 动物医学学院/中兽医药现代化山西省重点实验室,山西 太谷 030801;2.吉林大学 动物医学学院,长春 130015;3.山西农业大学 实验动物管理中心,山西 太谷 030801)

犬乳腺肿瘤是母犬中最常见的肿瘤,发病初期会出现嗜睡,体重减轻,咳嗽,淋巴水肿等症状[1-2]。根据调查发现,犬乳腺肿瘤占犬肿瘤疾病的50%左右,且多数为恶性肿瘤[3-5]。应用手术对病变部位切割是最保守的治疗方法[6],但病灶复发的可能性高[7];化疗在临床上常以辅助治疗,但治疗过程中多伴有腹泻,呕吐,中性粒细胞减少等症状,甚至会导致病犬死亡[8-9]。近年来,越来越多的研究人员开始聚焦犬乳腺肿瘤细胞,探讨抗肿瘤新药的作用效果和作用机制,为后期体内研究提供理论基础[10-11]。为保护正常细胞免受药物带来的毒性作用,首应将药物应用于犬乳腺上皮细胞进行安全评价。原代乳腺上皮细胞直接来自动物新鲜组织或乳汁,分离的细胞适应体内到体外的环境变化后,恢复原有的增殖分裂能力,保留原有组织的特性,后续可用于药物的毒性研究[12]。目前,尚没有犬乳腺上皮细胞系可代替原代细胞进行上述研究。因此,对犬乳腺上皮细胞进行简单便捷的分离及寻找适宜的培养方法至关重要。

体外获得乳腺上皮细胞的方法包括组织块贴壁法、酶消化法和乳汁分离法。孙培皓等[13]利用改进的酶消化法从乳腺分离得到奶牛的原代乳腺上皮细胞,为进一步探讨奶牛乳腺细胞的功能与泌乳机制提供技术支持;宣超莹等[14]采用组织块贴壁法成功分离绵羊乳腺上皮细胞,利用LPS刺激乳腺上皮细胞成功建立炎症模型,为后续研究绵羊乳房炎的机制提供扎实基础。但这两种方法分离得到的乳腺上皮细胞多有成纤维细胞掺杂,需用差时消化法多次进行纯化,操作繁琐,耗时过长,容易使乳腺细胞活力降低且易受到污染[15]。相比前者,乳汁分离法分离得到的乳腺上皮细胞纯度高,可以快速扩增,但对乳汁质量要求较高,否则难以成功。胡静思等[16]曾利用乳汁分离法成功分离出犬乳腺上皮细胞,但对细胞的生长条件没有系统概述;Bakirel等[17]利用组织块贴壁法成功分离出犬乳腺上皮细胞,但分离出的细胞包含大量成纤维细胞,需进一步纯化才能得到纯度高的乳腺上皮细胞。研究发现,前人在培养不同动物的乳腺上皮细胞时所使用的培养基有差异(表1),发现同一种属的乳腺上皮细胞在有无培养添加物(EGF、转铁蛋白等)的情况下均可以增殖分裂。因此,本研究在前人分离犬乳腺上皮细胞的基础上进行了优化,并将其接种于常用的两种培养基,对比两者的成活率和生长情况,为后期分离犬乳腺上皮细胞得出一个较优的培养方案。

表1 不同动物的乳腺上皮细胞培养基Table 1 Mammary epithelial cell culture medium for different animals

1.1 主要试剂与仪器

DMEM/F12购自美国Gibco公司,表皮生长因子、转铁蛋白、氢化考的松、青链霉素混合液、胰蛋白酶、DMSO、羊抗兔IgG-FITC和山羊封闭血清购自中国Solarbio公司,胎牛血清购自以色列Biological Industries公司,角蛋白8(Cytokeratin 8)抗体购自武汉proteintech公司;荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)。

基础培养基：DMEM/F12+10%FBS+1%青链霉素混合液。

完全培养基：DMEM/F12+10%FBS+1%青链霉素混合液+10 ng/mL EGF+5 μg/mL转铁蛋白+1 μg/mL氢化考的松。

1.2 试验方法

1.2.1乳汁的采集与乳腺上皮细胞的分离

试验取材自饲养于山西晋中小型犬舍健康泌乳一周的金毛犬。使用生理盐水将乳房冲洗干净,随后用75%酒精对乳头进行消毒,在无菌条件下采集乳汁并放于保温盒带回实验室。将乳汁与含有1%青链霉素混合液的PBS按2∶1的比例混匀,1 500 r/min 离心5 min,弃去上层乳脂层和中间浑浊液体,加入等体积的PBS,再次离心重复上述步骤,直至离心结束液体澄清[18-19]。分别加入完全培养基和基础培养基重悬细胞并转移到适宜的培养瓶,5% CO237 ℃条件下培养。每3 d换液1次,长满瓶底后传代。

1.2.2细胞冻存后复苏活力检测

将完全培养基培养的第6代细胞进行冻存(冻存液：FBS∶DMSO=9∶1),提前配置好冻存液后放入4 ℃冰箱预冷备用,细胞以1×106个/mL进行冻存,每管1 mL移入细胞冻存管,放入梯度冻存盒并转到-80 ℃冰箱,过夜后转移至液氮保存。3 d 后取出细胞,迅速在37 ℃恒温水浴锅解冻,随后1 000 r/min离心5 min,将细胞接种于六孔板观察。

1.2.3间接免疫荧光法鉴定犬乳腺上皮细胞

取长至单层的犬乳腺上皮细胞,消化后接种至48孔板,过夜培养,随后弃去培养液,4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗3次,加入0.2%的TritonX-100处理细胞5 min,PBS清洗3次,加入10%山羊血清封闭30 min,PBS清洗3次。按1∶100配置兔Cytokeratin 8一抗溶液加入48孔板,同时设立阴性对照组,每孔加入等量PBS。4 ℃过夜孵育后洗涤,按1∶200比例配置FITC标记的羊抗兔二抗溶液,加入48孔板,常温孵育1 h,PBS清洗3次,加入DAPI染液染色3 min,随后倒置荧光显微镜观察。

1.2.4CCK-8法绘制细胞生长曲线

取基础培养基和完全培养基培养的第3代细胞,消化处理后制备成细胞悬液,以每孔3～5×103个细胞量接种于96孔板,同时设置3个重复孔,5% CO237 ℃条件下培养7 d,每24 h取一个96孔板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,恒温放置1 h,450 nm测量每孔的OD值,并以培养天数为横坐标,细胞OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2.1 细胞形态学观察

将细胞离心处理后分别使用基础培养基和完全培养基重悬细胞,接种到6孔板,两种培养基接种的原代细胞生长情况见表2。基础培养基接种的细胞长满后每4 d进行一次传代,随着传代次数的增加,细胞状态逐渐变差,死亡细胞明显增多,在传至第4代时细胞仅有少部分能够贴壁,这说明基础培养基并不能满足细胞生长所需的条件(图1(f));完全培养基接种的细胞每3 d进行一次传代,细胞呈“鹅卵石铺路样”成片生长(图1(h)箭头所指)。随着传代次数的增加,细胞状态稳定,死细胞并没有明显增多,但要将长满的细胞及时传代,否则部分细胞会有“空泡化”现象(图1(i)箭头所指)。在消化时间上两者差异较大,基础培养基培养的细胞消化2 min完全脱离瓶底,以聚集在一起的团块为主漂浮在培养基中,离心重悬后使用移液枪反复吹吸可将细胞吹散;完全培养基培养的细胞消化8～10 min可将胞间伪足完全消化,细胞没有大量聚集,零散分布在培养基。综上所述,两种培养基下细胞的形态不一,基础培养基只能维持4代以内细胞生长,完全培养基可进行多次传代且细胞没有衰老迹象。

表2 两种培养基接种细胞的生长情况Table 2 Growth of cells seeded with two types of media

2.2 冻存后复苏细胞状态

将第6代完全培养基培养的细胞复苏并接种24 h后,已有大量细胞贴壁并增殖分裂(贴壁细胞占细胞总量的80%),细胞状态良好,随后的48 h细胞平铺满整个板底(图2)。

2.3 间接免疫荧光法鉴定犬乳腺上皮细胞

将两种培养基培养的第3代细胞接种于48孔板,过夜培养后间接免疫荧光检测细胞角蛋白8表达,同时设置阴性对照孔,结果如图3所示,两种培养基培养的细胞间接免疫荧光结果均为阳性,同时阴性对照组没有绿色荧光,证明分离的细胞均为犬乳腺上皮细胞。

2.4 CCK-8法绘制细胞生长曲线

将两种培养基培养的第3代细胞以每孔5×103个的数量接种,绘制两种培养基下的细胞生长曲线。基础培养基下的细胞生长较为缓慢,在第3天细胞生长达到峰值,随着培养时间的延长,死细胞增多,随后分裂几乎停止且状态逐渐变差,可见在基础培养基下,细胞并没有大量增殖分裂(图4(a));完全培养基培养的细胞在24 h内贴壁,并以伪足和其他细胞相连生长,前两天细胞生长缓慢,处于稳定期,第3～5天呈指数生长,在第6天细胞增殖逐渐平稳,整体生长趋势呈现“S”形,具有细胞分裂增殖的基本特征(图4(b))。

目前乳腺上皮细胞的分离方法主要有酶消化法、组织块贴壁法和乳汁分离法。杨玉莹等[20]采用胰酶和Ⅰ型胶原酶分段消化牦牛乳腺组织块,通过分子表型及功能鉴定纯化后的细胞可阳性表达角蛋白18及β-酪蛋白,成功分离出牦牛乳腺上皮细胞;朝格图[21]通过组织块贴壁法成功分离到能表达β-酪蛋白的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,但分离出来的上皮细胞多有成纤维细胞的混合,需经差速贴壁法、差时消化法等方法对细胞进行纯化,经4～5次纯化处理可以得到纯度较高的乳腺上皮细胞[22-24]。

(a)乳汁离心分离细胞并接种(10×);(b)接种24 h后的“煎蛋样”细胞(40×);(c)完全培养基接种4 d后出现的“岛屿状”细胞(20×);(d)～(f)为基础培养基接种的细胞：(d)细胞培养9 d出现的细胞单克隆(10×);(e)细胞培养12 d后出现大面积细胞(10×);(f)细胞消化传代后贴壁较快,但生长速度较慢(10×);(g)～(i)为完全培养基接种的细胞：(g)细胞培养9 d出现大面积拉网现象(10×);(h)细胞长满后消化传代,呈“鹅卵石铺路样”生长(20×);(i)有“空泡化”现象的部分细胞(10×)。(a) Milk was centrifuged to separate cells and seeded (10×);(b) “Fried egg-like”cells 24 h after seeding (40×);(c) “Island-like”cells that appeared 4 d after complete medium seeding (20×);(d)-(f) are the cells inoculated in the basal medium：(d) The cell monoclonal appeared after 9 days of cell culture (10×);(e) The large area of cells appeared after 12 days of cell culture (10×);(f) After the cells were digested and passaged,the post-adherence is faster,but the growth rate is slower (10×);(g)-(i) are cells inoculated in complete medium：(g) The cells were cultured for 9 days with a large area of netting phenomenon (10×);(h) After the cells were overgrown digested and passaged,it grows like “cobblestone paving”(20×);(i) Some cells being “vacuolated”(10×).图1 犬乳腺上皮细胞形态观察Fig.1 Morphological observation of canine mammary epithelial cells

但要控制酶的消化时间,若控制不当易对上皮细胞造成损伤。

乳汁分离法在牛等大型动物应用校多[18-19],小动物与牛相比乳汁分泌量少,但也有成功分离出乳腺上皮细胞的研究。胡静思等[16]从泌乳期比格犬的乳汁中分离出乳腺上皮细胞,比格犬作为试验常用的动物模型,结果具有稳定性,可重复性的优点,但实验性比格犬的饲养条件繁琐且大多用于临床毒理试验[25],探讨普通家养犬能否通过乳汁分离法分离出乳腺上皮细胞是本研究的目的之一。因此本研究取材自普通环境饲养的泌乳期金毛犬,金毛犬作为最常见的大型家犬之一,性格友好易于管理,泌乳期乳汁分泌多,为后期分离培养乳腺上皮细胞提供良好条件。

(a)复苏后的细胞接种(10×);(b)细胞接种培养24 h(20×);(c)细胞接种培养48 h(20×);(d)细胞接种培养72 h(20×)。(a) Cell seeding after resuscitation (10×);(b) Cell seeding culture for 24 h (20×);(c) Cell seeding and culture for 48 h (20×);(d) Cell seeding culture for 72 h (20×).图2 冻存后复苏细胞状态Fig.2 Recovery of cell status after cryopreservation

乳房上皮在妊娠期间会大量生成,妊娠晚期分化为可以泌乳的细胞[26],随着哺乳的进行,大量乳腺上皮细胞会脱落到乳汁中并排出,且多数细胞具有活性[27],因此试验取材需选择处于泌乳早期的动物。本研究参照了前人乳汁分离乳腺上皮细胞的方法,将乳汁收集后加含有1%青链霉素混合液的PBS离心重悬[18-19],但培养不同种属的乳腺上皮细胞时所使用的培养基并不完全相同,且细胞培养的过程没有清晰阐述,因此本研究在已有的基础上选取了两种常用的乳腺上皮细胞培养基,同时接种犬原代乳腺上皮细胞于大小不同的培养皿,通过观察细胞的形态,检测细胞角蛋白8(Cytokeratin 8)的表达,观察细胞冻存复苏活力,绘制细胞的生长曲线来评估最适宜的培养方案。经研究发现,采集乳汁时尽量选择泌乳早期的犬,这期间脱落的乳腺上皮细胞的活性较高,有利于细胞增殖;乳汁洗涤离心时,要尽量把乳汁中的乳脂去除干净,否则细胞容易污染;接种时要注意细胞密度与培养皿大小的选择,如果接种密度过小会影响细胞的增殖与细胞间伪足的产生,接种的培养皿过大会造成贴壁细胞密度不一,影响细胞后期的增殖分化,本研究最终将细胞接种至6孔板,便于细胞分布均一,有利于后期增殖与传代;Cytokeratin 8作为上皮细胞的标志性蛋白可用来鉴定乳腺上皮细胞[28],本研究中两种培养基下培养的第2代与第3代细胞均有Cytokeratin 8的大量表达,同时在细胞传代过程中发现两者分别在消化时间上一致,没有差异性,证明所分离的细胞为犬乳腺上皮细胞。

(a)完全培养基培养细胞Cytokeratin 8阳性(40×);(b)完全培养基培养细胞阴性对照(40×);(c)基础培养基培养细胞Cytokeratin 8阳性(40×);(d)基础培养基培养细胞阴性对照(40×)。(a) Cytokeratin 8 positive for cells cultured in complete medium (40×);(b) Negative control for cells cultured in complete medium (40×);(c) Cytokeratin 8 positive for cells cultured in basal medium (40×);(d) Negative control for cells cultured in basal medium (40×).图3 间接免疫荧光法鉴定犬乳腺上皮细胞Fig.3 Identification of canine mammary epithelial cells by indirect immunofluorescence

体外培养犬乳腺上皮细胞时发现,基础培养基培养前期单个贴壁细胞会分裂成细胞单克隆,但胞间没有拉网大面积生长,消化传代后没有快速分裂增殖且随着培养时间的延长而状态变差;完全培养基培养的细胞生长迅速,胞间以伪足相连,细胞形态舒展为“鹅卵石铺路样”且大面积生长,消化传代后3 d即可长满,但要及时将长满的细胞进行传代,否则细胞会出现“空泡化”现象直至死亡,且细胞传代后“空泡化”现象依旧没有改善,同时消化时间控制在10 min左右,避免时间过长影响细胞活力;对2种培养基培养的细胞绘制生长曲线可以看出完全培养基符合细胞分裂的基本特征,以上表明在犬原代乳腺上皮细胞的培养过程中,单一的培养基跟胎牛血清并不能满足细胞生长的营养要求,在培养基中添加表皮生长因子(EGF)、转铁蛋白和氢化考的松是犬乳腺上皮细胞快速增殖分裂的必然条件。

(a)基础培养基所培养细胞的生长曲线;(b)完全培养基所培养细胞的生长曲线。(a) Growth curve of cells cultured in basal medium;(b) Growth curve of cells cultured in complete medium.图4 犬乳腺上皮细胞生长曲线Fig.4 Growth curve of canine mammary epithelial cells

犬乳腺肿瘤作为母犬中最常见的肿瘤之一,对犬造成的危害巨大,传统治疗方法有局限性,治疗不彻底还会复发[6-7],因此寻找能运用于临床且副作用小的药物是接下来的研究重点。乳腺上皮由外层的肌上皮细胞和内部的管腔细胞构成[29-30],而犬的乳腺肿瘤恰由管腔上皮细胞、肌上皮细胞、间质结缔组织构成,说明犬乳腺癌的发生发展与乳腺上皮细胞有密切联系[31-32],首先在细胞水平上观察药物的毒性作用是至关重要的。原代乳腺上皮细胞保留了乳腺的特异性功能和信号转导,最能代表体内状态,本研究从泌乳期金毛犬的乳汁中分离得到乳腺上皮细胞,可作为抗肿瘤药物的细胞模型,初步筛选药物的作用浓度,提高后续抗肿瘤研究的可靠性;也可同犬乳腺肿瘤细胞进行对比研究,探讨抗肿瘤药物在犬乳腺肿瘤细胞的作用靶点,为后期了解犬乳腺癌的发生发展与药物对犬乳腺肿瘤的作用机制提供扎实基础。因此掌握能够快速分离犬原代乳腺上皮细胞的方法并选用合适的培养方案是极为重要的,为研究犬乳腺肿瘤的发病机制提供稳定的细胞模型与技术支持。

本研究利用乳汁分离法成功分离出犬原代乳腺上皮细胞,发现与基础培养基相比,完全培养基可以更好地维持细胞活性,促进细胞增殖分裂,且不影响细胞冻存后复苏的活力,为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。

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