末端回肠结节样淋巴组织增生患者临床病理特征及肠道菌群变化的研究

江巧丽 赵梦琦 崔梦妍 陆 游 陆颖影

小肠结节样淋巴组织增生（NLH）是一种较罕见的疾病，其特点是小肠黏膜表面的多发性小结节，其诊断主要依据内镜和活体组织病理检查，可见明显的淋巴滤泡增生，淋巴细胞有丝分裂活跃的生发中心，其主要临床表现为慢性腹泻、腹痛、便血、贫血、低蛋白血症等[1-2]。有研究报道NLH 可能与肠内外淋巴瘤有关，肠外淋巴瘤患者的NLH经化学治疗后可消失[3-5]。NLH 的病因尚不清楚，有假说认为可能是由感染引起，肠道抗原反复刺激引起淋巴滤泡增生，有研究报道在幽门螺杆菌（Hp）、贾第虫感染患者中发现NLH[6-8]；
另一种观点是NLH 与免疫缺陷所致淋巴细胞成熟障碍有关，导致浆细胞前体在淋巴滤泡中聚集，有研究报道在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、常见变异型免疫缺陷病患者中发现NLH[9-10]。

末端回肠NLH 是指肠镜下可见末端回肠有多发性散在的粒状或圆形结节。NLH 患者可无明显症状，也可表现为慢性腹泻、腹痛和便血等[11]。目前国内有关末端回肠NLH 的研究报道较少，本研究回顾性分析了末端回肠NLH 患者的临床病理特征，并对其肠道菌群的变化进行了初步研究，以期对末端回肠NLH 的诊治和发病机制研究提供参考。

1.1 一般资料

选 择2021 年1 月1 日 至2021 年11 月30 日 在上海市第一人民医院嘉定分院经肠镜及活体组织病理检查确诊为末端回肠NLH 的80 例患者，在其中随机选择15 例患者设为NLH 组，另选择15名末端回肠黏膜正常的同期健康体检者设为对照组。入选者排除了糖尿病、炎症性肠病（IBD）、结肠切除手术史、结直肠癌及BMI≥30 kg/m2。比较2 组的一般资料及实验室指标，并在肠镜下取末端回肠黏膜组织进行菌群测序和病理组织学分析。所有入选者均签署知情同意书，本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 收集临床资料 收集入选者的一般资料，包括性别、年龄、BMI、临床症状，并收集实验室检查结果资料，包括血常规、红细胞沉降率（ESR）、C 反应蛋白（CRP）、白蛋白、Hp感染检测[13C 尿素呼气试验（UBT）和快速尿素酶试验（RUT）中有1 项阳性即诊断为感染]。

1.2.2 16S rRNA 肠黏膜菌群测序 所有样本均由同一位实验人员进行DNA 提取和PCR 扩增。通过化学裂解法裂解细胞膜及细胞核膜，后 续DNA 提 取 步 骤 按 照E.Z.N.A.®Stool DNA Kit 试剂盒（购自美国Omega 公司）的说明书进行。以每个样本提取的DNA 为模板，扩增16S rRNA 基 因 的V3～V4 区 域，通 用 细 菌 引 物为F1 和R2（5"-CCTACGGGNGGCWGCAG-3"和5"-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3"）。将不同样品的产物按相同比例进行混合，由上海慕柏生物医学技术有限公司使用Illumina Miseq 平台测序。获得OTU 丰度矩阵之后，通过分析体现群落丰富度的Chao 指数和ACE 指数，以及体现群落均匀度的Shannon 指数和Simpson 指数，计算每个样本群落的多样性（即α 多样性）。Chao 指数或ACE 指数越大则群落的丰富度越高，Shannon 指数或Simpson指数越大则群落的多样性越高。

1.2.3 H-E 染色和免疫组织化学染色 活体组织标本采用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行H-E染色。免疫组织化学染色步骤是将石蜡切片脱蜡至水，柠檬酸抗原修复缓冲液（pH＝6.0）进行抗原修复，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，BSA 或血清封闭（一抗是山羊来源的用10%正常兔血清封闭，一抗是其他来源的用3% BSA 封闭），一抗孵育，二抗孵育，DAB 显色，Harris 苏木素复染细胞核，脱水封片，最后在光学显微镜下进行图像采集分析。一抗Occludin、ZO-1、CD3、CD19和CD20 均购自武汉赛维尔生物科技有限公司，其稀释比例分别为1︰600、1︰400、1︰1 000、1︰400 和1︰500。

1.2.4 肠黏膜病理和免疫组织化学染色结果分析 15 例末端回肠NLH 组织和15 例正常末端回肠黏膜组织均行H-E染色和免疫组织化学染色。H-E染色后，光学显微镜下观察小肠组织病理变化，并行Chiu"s 肠黏膜损伤评分：肠黏膜正常记0 分；
绒毛顶端上皮下间隙增宽伴毛细血管淤血记1 分；
上皮下间隙扩张伴上皮层与固有层中度分离记2 分；
大片上皮层从绒毛两侧与固有层分离，部分绒毛顶端破损记3 分；
绒毛破损伴固有层毛细血管暴露，有可能观察到固有层细胞成分增多记4 分；
固有层破坏和不完整，有出血和溃疡形成记5 分。免疫组织化学染色结果分析：细胞膜呈线条状棕黄色染色为Occludin 蛋白和ZO-1 蛋白阳性。以全自动图象分析仪对其所得染色灰度值进行分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS 25.0 软件对数据进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。非正态分布的计量资料采用非参数Mann-WhitneyU检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 一般资料

80 例 末 端 回 肠NLH 患 者 中， 男 性65 例（81.25%），女性15 例（18.75%），年龄14～69 岁，平均年龄为（35.43±13.04）岁，其中年龄≤20岁 有6例（7.50%）， 21～30 岁 有25 例（31.25%），31～40 岁 有24 例（30.00%），41～50 岁 有16例（20.00%），51～60 岁有2 例（2.50%），＞60 岁有7例（8.75%）。从80 例NLH 患者中随机选取的15例NLH 组患者中，男性11 例，女性4 例，平均年龄为（33.06±7.22）岁；
15 名对照者中，男性7 例，女性8 例，平均年龄为（37.87±4.51）岁；
2 组的年龄及性别构成差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2 临床症状和实验室检查

80 例末端回肠NLH 患者中，主要症状为腹泻者33 例（41.25%），腹痛、腹胀16例（20.00%）；
血常规检查示白细胞和中性粒细胞比例均无异常，仅1 例患者有轻度贫血（血红蛋白为110 g/L），其余患者无贫血。

根据病历资料，80 例末端回肠NLH 患者中有25 例患者进行了Hp感染的检测，包括UBT 和（或）RUT，其中15 例（60.00%）患者Hp阳性。另随机选择同期在该院行Hp感染检测并行肠镜检查示末端回肠正常的25 例就诊者（平均年龄和性别构成与25 例末端回肠NLH 患者相似），其中13 例（52.00%）患者Hp阳性。两者比较结果显示，末端回肠NLH 患者的Hp感染率较末端回肠正常者升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

15 例NLH 组 患 者 和15 名 对 照 者 的BMI、血常规相关指标、ESR、CRP、白蛋白检查结果的差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1 2 组的指标比较

2.3 肠道菌群分析

16S rRNA 测序分析结果显示，NLH 组的ACE指数和Chao 指数均高于对照组（416.52±6.92 比383.16±10.02，399.00±10.42 比353.73±12.17，P均＜0.05）；
NLH 组 的Shannon 指 数 和Simpson 指数均高于对照组，但差异均无统计学意义（P均＞0.05）。结果表明末端回肠NLH 患者肠黏膜菌群的α 多样性高于对照组，提示末端回肠NLH 患者可能存在小肠细菌过度生长（SIBO）。见图1。

图1 2 组的末端回肠黏膜菌群 α 多样性比较 A ACE 指数 B Chao 指数

2.4 组织学分析

末端回肠NLH 的内镜下表现为末端回肠黏膜表面多发性散在的粒状或圆形结节，直径为2～5 mm，见图2。H-E 染色后在光学显微镜下可见肠黏膜层淋巴滤泡增生及有丝分裂活跃的生发中心，见图3。免疫组织化学染色示增生的淋巴滤泡中以表达CD19、CD20 的B 细胞为主，并有少量表达CD3 的T 细胞，见图4。H-E 染色后在光学显微镜下可见正常末端回肠组织和末端回肠NLH 组织的黏膜绒毛均完整无中断，肠上皮细胞间紧密连接均完整。应用图象分析仪对2 组的末端回肠黏膜组织中肠上皮紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 表达水平进行定量分析，比较结果显示2 组的差异均无统计学意义（P均＞0.05），见图5。NLH 组和对照组的Chiu"s 肠黏膜损伤评分分别为（1.87±0.72）分和（1.53±0.62）分，2 组评分的差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 正常末端回肠和末端回肠NLH 的内镜图像 A 正常末端回肠 B 末端回肠NLH

图3 正常末端回肠和末端回肠NLH 组织的病理图像 ×100 H-E 染色 A 正常末端回肠组织 B 末端回肠NLH 组织

图4 末端回肠NLH 组织的淋巴滤泡中细胞分析 免疫组织化学染色 ×100 A 淋巴滤泡中以CD19 阳性的B 细胞为主 B 淋巴滤泡中以CD20 阳性的B 细胞为主 C 淋巴滤泡中有部分CD3 阳性的T 细胞

图5 正常末端回肠和末端回肠NLH 的组织学分析 A 正常末端回肠组织 H-E 染色 ×200 B 末端回肠NLH 组织 H-E 染色 ×200 C 正常末端回肠组织中Occludin 表达 免疫组织化学染色 ×100 D 末端回肠NLH 组织中Occludin 表达 免疫组织化学染色 ×100 E 正常末端回肠组织中ZO-1 表达 免疫组织化学染色 ×100 F 末端回肠NLH 组织中ZO-1 表达 免疫组织化学染色 ×100

随着结肠镜检查的普及和技术提高，末端回肠NLH 的诊断率较以往明显升高。本研究中，在2021 年1 月1 日至2021 年11 月30 日的3 423 例接受肠镜检查的患者中发现80 例末端回肠NLH 患者，NLH 发病率为2.3%，人群分布以中青年人群占比较高。在临床表现上，41.25%的患者表现为反复腹泻，20.00%的患者有腹痛、腹胀症状，与既往文献报道相似[6]。本研究仅发现1 例末端回肠NLH 患者有轻度贫血，无低蛋白血症，炎性反应指标未见异常，无其他严重伴发疾病，故认为末端回肠NLH 为良性疾病，一般无严重不良预后。需要注意的是，淋巴瘤有可能误诊为NLH，需通过活体组织病理检查以明确诊断。

本研究应用16S rRNA 技术对末端回肠NLH组织进行肠黏膜菌群测序分析，结果显示其α 多样性明显高于正常末端回肠黏膜，提示肠道菌群紊乱与末端回肠NLH 的发生可能存在相关性，可能与SIBO 导致局部炎性反应，刺激淋巴滤泡增生有关。SIBO 是指由多种原因引起的小肠细菌数量增加和（或）种类构成异常并伴有胃肠道症状的临床综合征，多由于结肠菌群因各种原因移位至小肠，导致小肠黏膜发生炎性反应、通透性增高及绒毛损伤，主要表现为营养吸收不良、腹痛、腹胀、腹泻和小肠动力异常等[12]。SIBO 与结直肠癌、肠易激综合征（IBS）、IBD、非酒精性脂肪性肝病等密切相关[13-16]。本研究发现末端回肠NLH 患者肠黏膜菌群的α 多样性增高，可能通过促发炎性反应刺激B 细胞增生、淋巴滤泡形成，从而导致末端回肠NLH 的发生、发展。有研究表明IBS 患者肠道发生NLH 的风险增高[17]，肠道菌群紊乱与IBS 有关[18]，调节肠道菌群是目前治疗IBS 的有效方法之一，对末端回肠NLH 患者补充益生菌可改善症状[19]。有研究结果显示，NLH 可能与肠内外淋巴瘤有关[4-5]，故调节肠道菌群的稳态可能有助于减轻甚至治愈末端回肠NLH，从而降低淋巴瘤的发生风险。本研究通过H-E 染色及肠上皮紧密连接蛋白的免疫组织化学染色分析发现，末端回肠NLH 的肠黏膜屏障未见明显改变，这提示肠道菌群改变并不影响肠黏膜屏障的完整性，不影响营养物质的吸收，一般不会导致贫血及低蛋白血症，但肠道菌群的改变是否是导致疾病进展的危险因素尚不明确。

文献报道，Hp感染与十二指肠NLH 相关，Hp根除后十二指肠NLH 会减轻[6]。已知Hp感染与MALT 淋巴瘤相关，而文献报道末端回肠NLH与肠内外淋巴瘤相关[4-5]。本研究中发现末端回肠NLH 患者的Hp感染率较正常末端回肠者升高，但差异无统计学意义，这可能是由于样本量较小。因此，对于在肠镜下发现末端回肠NLH 的患者，可进行Hp感染检测，这可能使患者在预防淋巴瘤发生中获益。

末端回肠NLH 患者的临床表现无特异性，可出现腹泻、腹痛、腹胀等症状，但不会引起小肠吸收不良，这与小肠疾病不同。本研究通过回顾性分析对末端回肠NLH 患者的临床病理特征进行了探讨，并进行了回肠末端黏膜菌群的初步分析，以期加深临床医生对该病的认识，并对末端回肠NLH的诊治和发病机制研究提供参考。临床上对部分患者补充益生菌、调节肠道菌群可使其症状缓解，本研究的发现为临床治疗提供了依据。本研究存在一定的局限性，如样本量较小；
临床资料缺乏患者饮食习惯、生活习惯等调查数据，从而未判断末端回肠病变是否源于上消化道功能状态及宿主因素；
未能判断末端回肠细菌增多是否与结肠菌群来源有关；
缺乏对末端回肠NLH 严重程度的定量评价；
缺乏治疗后随访数据，如Hp根除后末端回肠NLH 的变化等；
这些将在后续研究中继续探索。目前末端回肠NLH 的自然病程是自愈还是进展，以及其演变为淋巴瘤的危险因素尚未明确，需要进一步研究。

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