Cry类和Vip3Aa类Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力和增效作用

胡小华 王振营 何康来 解海翠 王月琴

摘要 筛选对靶标害虫高效的Bt杀虫蛋白、评价蛋白组合对靶标害虫的杀虫作用，对于转基因抗虫新品种的研发具有重要的指导意义。本文采用人工饲料混合法评价了Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19共8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力;同时评估了Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合蛋白对亚洲玉米螟的杀虫作用，筛选出毒力最佳的组合比例。结果表明：Cry1Ab、Cry1Fa、Cry2Aa对亚洲玉米螟的LC50在0.24～0.72 μg/g之间，其中Cry1Ab的毒力最强，显著高于Cry1Fa和Cry2Aa蛋白，Cry1Fa与Cry2Aa毒力无显著性差异。Cry1Ca、Cry1Ba、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19对亚洲玉米螟的LC50均大于50 μg/g。当Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例为1∶1时，增效作用最强，增效因子分别为3.18和1.58。本研究结果为多价转基因玉米的研发提供了重要依据。

关键词 Bt; Cry; Vip3Aa; 亚洲玉米螟

中图分类号：
S 433.4

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021671

Abstract Selection of Bt toxin with high efficiency and evaluation of insecticidal effects between toxins against target pests is very important for development of new transgenic insect-resistant varieties. We evaluated the toxicities of Cry1Ab， Cry1Fa， Cry1Ca， Cry1Ba， Cry2Aa， Vip3Aa11， Vip3Aa19 and Vip3Aa20 against Ostrinia furnacalis by diet-incorporation bioassay， as well as the possible interaction between Cry1Ab and Vip3Aa19， Cry1Fa and Vip3Aa19 toxins， and select the proportion of the best combination of toxins. The LC50 values of Cry1Ab， Cry1Fa and Cry2Aa ranged from 0.24 to 0.72 μg/g. Among them， Cry1Ab had the highest toxicity， significantly different from Cry1Fa and Cry2Aa， and Cry1Fa and Cry2Aa had no significant difference. The LC50 values for Cry1Ca， Cry1Ba， Vip3Aa11， Vip3Aa20 and Vip3Aa19 were all higher than 50 μg/g. When bioassays were performed with toxin mixture at the ratio of 1∶1， the Cry1Ab/Vip3Aa19 and Cry1Fa/Vip3Aa19 showed synergistic effect， with synergism factors of 3.18 and 1.58， respectively. The above results could be useful for developing of pyramided transgenic maize.

Key words Bacillus thuringiensis; Cry; Vip3Aa; Ostrinia furnacalis

自1996年美國首次批准商业化种植转基因抗虫玉米防治欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis以来，转基因作物在全球范围内已经连续种植25年。截至2019年，全球26个国家种植了1.904亿hm2转基因作物［1］。转基因抗虫作物不仅有效防治了靶标害虫，减少了杀虫剂的使用量，而且保护了天敌和生物多样性，增加了农民的收入［2-4］。然而，转基因作物的大面积推广使靶标害虫长期处于一定的筛选压力之下，导致田间抗性种群的产生，如亚澳白裙夜蛾Busseola fusca和地中海玉米蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioides对Cry1Ab、西部玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera 对Cry3Bb1、小蔗螟Diatraea saccharalis 对Cry1F 和Cry1A.105等［5-8］。

第一代转基因玉米主要表达Cry1Ab蛋白（‘MON810‘Bt11‘Bt176）、Cry1Ac蛋白（‘DBT-418）、Cry1F蛋白（‘TC1507）、Cry9C蛋白（‘CHB-351）;第二代转基因抗虫作物是将两个或者多个基因同时导入同一植株内，用来防治同一种害虫，达到延缓抗性产生、扩大杀虫谱的目的［9］。如‘MON89034（表达Cry2Aba/Cry1A.105蛋白）、‘MON88017（表达Cry1Fa/Cry1Ab蛋白）、‘Bt11×MIR162（表达Cry1Ab/Vip3Aa20蛋白）等［10］。选择蛋白组合时，不仅要考虑蛋白的互补性、蛋白结合受体位点的能力，同时需要考虑蛋白间的协同增效作用或拮抗作用［11］。增效作用能提高防治效力，达到1+1>2 的效果;相反，拮抗作用削弱了聚合多种Bt杀虫蛋白的优势，降低防治效果。蛋白之间的相互作用可以通过评价单个蛋白的毒力和蛋白混合物的毒力效果来判断［12］。

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是为害我国玉米的重要害虫，对玉米生产和农业安全造成严重的威胁［13-14］。室内生测表明多种Cry1类蛋白对玉米螟具有较高的毒力，如Cry1Aa、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1Ie［15-17］等;田间抗性鉴定结果表明转基因抗虫玉米‘Bt799‘Bt11和‘MON810对亚洲玉米螟有很高的杀虫效果和良好的田间抗螟性［18-20］。草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda 是世界性重大迁飞害虫，自2019年1月入侵我国云南省后，进一步蔓延扩散至黄淮海夏玉米主产区，对我国玉米等作物生产安全构成严重威胁。室内生测结果表明：转cry1Ab基因玉米和转cry1Ab/vip3Aa玉米对草地贪夜蛾具有良好的控制效果［21］。2020年1月21日，国产转基因抗虫玉米‘DBN9936（表达Cry1Ab蛋白）和‘瑞丰125（表达Cry1Ab和Cry2Aj蛋白）获得了在北方春玉米区的生产应用安全证书;2021年1月11日，‘DBN9936扩区审批至黄淮海夏玉米区、西南玉米区、南方玉米区。2021年，农业农村部对转基因玉米开展了产业化试点。

Cry1Ab、Cry1Fa和Vip3A是目前国际上商业化应用最广泛的防治鳞翅目害虫的转基因抗虫玉米表达的 Bt 杀虫蛋白，因此，本文评估了8种杀虫蛋白（Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ba、Cry1Ca、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3A20）和2个组合（Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19）对亚洲玉米螟的毒力，筛选出Cry1Ab和Cry1Fa分别与Vip3Aa19组合的最佳毒力的比例，为多价转基因玉米的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

亚洲玉米螟室内敏感种群：原始种群于2015年6月采集自吉林省松原市普通玉米种植田，在室内无琼脂人工饲料［22］上连续饲养多代，饲养过程中未接触任何杀虫剂或Bt杀虫蛋白。

幼虫在温度（27±1）℃、相对湿度70%～80%、光周期L∥D=16 h∥8 h的条件下饲养。

1.2 供试Bt杀虫蛋白

Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa活化蛋白购自北京乐士宁科技有限公司（由美国Case Western Reserve University的Marianne P. Carey实验室生产，经胰蛋白酶活化的毒素），纯度为98%的白色粉末晶体，均用50 mmol/L、pH=10的Na2CO3溶解。Vip3Aa19、Vip3Aa20分别由北京大北农生物技术有限公司和先正达生物科技有限公司提供，均用1 mmol/L、pH=10的PBS溶解。Vip3Aa11购自美延（北京）农业科技有限责任公司，用1 mmol/L、pH=10的PBS溶解。

1.3 毒力测定

采用人工饲料混合法测定Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟幼虫的毒力，人工饲料配方具体参考宋彦英等［22］。主要步骤如下：

1）将Bt杀虫蛋白设置6～9个浓度梯度，保证幼虫死亡率在10%～90%。Cry1Ab和Cry1Fa的浓度设置为0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 μg/g;Cry2Aa的濃度设置为0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0 μg/g;Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3Aa20的浓度设置为0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0 μg/g。

2）混合蛋白与饲料。将对应剂量的蛋白加入蒸馏水中，混合均匀后与无琼脂半人工干粉饲料搅拌混匀，同时设置蒸馏水作为空白对照。

3）接入幼虫并封口。将混合均匀的人工饲料分装到 48孔培养板中，每孔用毛笔挑入1头初孵幼虫（孵化时间＜12 h），每个蛋白浓度3个重复，每个重复48头，共144头。然后用封口膜覆盖（Cat# 3M-9733， Minnesota Mining and Manufacturing Company， Minnesota， USA），防止试虫逃逸。并用解剖针扎孔，保证空气流通，避免湿度太大造成幼虫死亡。

4）饲养并调查结果。将所有培养板放置在温度（27±1）℃、相对湿度70%～80%、光周期L∥D=16 h∥8 h的培养箱内，饲养期间无需更换或添加饲料，7 d后调查试验结果，记录每板幼虫死亡数量。幼虫死亡评判标准：用毛笔轻触虫体尾部，虫体无反应或单头存活幼虫体重＜0.1 mg。

1.4 数据统计与分析

用对数-几率值法模拟剂量-死亡率反应曲线，统计计算过程采用PoloPlus Probit软件。根据95%置信区间判断差异性，如果置信区间有重叠，则无显著差异;如果置信区间无重叠，则有显著差异。

通过比较实际死亡率和预期死亡率，评价Cry类和Vip3A类蛋白间的相互作用。预期死亡率是在两种蛋白间不存在相互作用且独立发挥作用的假设下得到的死亡率［23］。根据Tabashnik的方法［11］：

LC50（m）=1raLC50（a）+rbLC50（b）

其中，LC50（m）：混合蛋白预期致死中浓度;LC50（a）和LC50（b）分别是蛋白a和蛋白b对靶标害虫的致死中浓度;ra和rb分别是a蛋白和b蛋白在混合蛋白中的比例。增效因子（synergism factor，SF）按如下公式计算：

SF=LC50（m）LC50

其中，LC50为混合蛋白对靶标害虫的实际致死中浓度。当SF>1时，表现为增效作用;当SF=1时，表现为叠加作用;当SF＜1时，表现为拮抗作用。

2 結果与分析

2.1 8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力

8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟幼虫的毒力测定结果如表1所示。LC50从0.24 μg/g到大于50 μg/g，其中Cry1Ab对亚洲玉米螟的毒力最强，LC50仅为0.24 μg/g。Cry1Fa和Cry2Aa对亚洲玉米螟的毒力显著低于Cry1Ab，LC50分别为0.52 μg/g和0.72 μg/g，但是两种蛋白的毒力不存在显著差异。Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa11、Vip3Aa19、Vip3Aa20对亚洲玉米螟的致死效果差，LC50均大于50 μg/g （表1）。

2.2 Cry1Ab和Vip3Aa19蛋白混合后对亚洲玉米螟的毒力

为了进一步明确Cry1Ab和Vip3Aa19之间的相互作用，评价了两种蛋白在不同混合比例下对亚洲玉米螟初孵幼虫的毒力，结果见表2。当Cry1Ab和Vip3Aa19混合的比例分别为1∶1和1∶2时，SF分别为3.18和1.32，均大于1，表明存在增效作用。其他比例组合的实际LC50均高于预期LC50，SF值范围为0.49～0.96，说明存在一定的拮抗作用。

2.3 Cry1Fa和Vip3Aa19蛋白混合对亚洲玉米螟的毒力

Cry1Fa/Vip3Aa19在不同混合比例下对亚洲玉米螟初孵幼虫的毒力测定结果表明：当Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例为1∶1和1∶2时，实际LC50均低于预期LC50，SF分别为1.58和1.32，均大于1，存在较弱的增效作用。当两种蛋白的混合比例为5∶1时，SF为1，表现为简单的相加作用。当两种蛋白的混合比例为2∶1和1∶5时，SF均小于1，说明存在一定的拮抗作用（表3）。

3 结论与讨论

不同Bt杀虫蛋白的杀虫谱不同，且对靶标害虫的毒力不同。因此，在研发转基因作物时，有必要评估不同Bt杀虫蛋白对靶标害虫的毒力。本文采用饲料混合法评价了8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力，其中Cry1Ab对玉米螟初孵幼虫的毒力效果最好，显著高于另外7种蛋白。Cry1Ab除了对亚洲玉米螟具有较强的毒力外，对其他鳞翅目害虫也具有较强的毒力，包括欧洲玉米螟、小菜蛾Plutella xylostella、草地贪夜蛾等［24-26］。1996年，以欧洲玉米螟和巨座玉米螟D.grandiosella为靶标害虫的转单价Bt玉米在美国商业化种植，包括转cry1Ab玉米（‘Bt11‘MON810）和转cry1Ac玉米（‘DBT-418）［9］。2002年，为了扩大杀虫谱、延缓抗性产生，美国和澳大利亚率先批准种植转双价基因棉花‘Bollgard II（表达Cry1Ac/Cry2Ab蛋白）防治美洲棉铃虫 Helicoverpa zea 和棉铃虫H.armigera。2011年，阿根廷开始种植‘Bt11×MIR162，主要防治草地贪夜蛾、小蔗螟等鳞翅目害虫［8，27-28］。前期研究结果表明，Vip3Aa对黏虫Mythimna separata、草地贪夜蛾、粉纹夜蛾Trichoplusia ni、烟芽夜蛾Heliothis virescens等鳞翅目害虫均具有较好的毒力［29-31］，本研究结果显示Cry1Ba、Cry1Ca、Vip3Aa对亚洲玉米螟没有毒力，可能是因为这些蛋白在玉米螟幼虫中肠上不存在相应的特异性结合位点。但是Vip3Ca对亚洲玉米螟敏感品系和Cry1Ab抗性品系均具有很好的毒力［32］。该试验结果为新基因的挖掘、转基因作物的研发提供了重要的参考信息。

随着转基因作物的不断推广，靶标害虫的抗性问题引起越来越多的重视。但在选择多个基因叠加时，不仅要考虑单个基因的毒力，还要考虑蛋白之间的相互作用［11， 33］。多个研究表明，当Cry类和Vip类蛋白混合时，存在增效、拮抗或者叠加作用。Bergamasco等［34］报道了Cry1Ia10和Vip3Aa相互作用的物种特异性。体外竞争结合试验表明，在草地贪夜蛾体内，Cry1Ia10和Vip3Aa具有不同的结合位点，表现为增效作用。在灰翅夜蛾S.eridania体内，两种蛋白竞争结合同一个受体位点，表现为明显的拮抗作用［34］。Cry9Aa和Vip3Aa蛋白在水稻二化螟Chilo suppressalis体内存在特异性结合并具有不同的受体结合位点是协同增效作用的主要因素［35］。本研究发现当Cry1Ab和Vip3Aa19、Cry1Fa和Vip3Aa19为1∶1混合时，表现为增效作用，表明共表达两种蛋白将提高转基因作物对亚洲玉米螟的防治效果，延缓抗性的产生。Vip3Aa和Cry1Ab对草地贪夜蛾具有显著的增效作用［36］;Cry1Fa和Vip3Aa19对黏虫亦有显著的增效作用［30， 37］。除了受体位点的不同，蛋白间氨基酸序列的差异也可能是产生增效作用的原因［38］。同种蛋白组合的相互作用可能因为受试靶标的不同而不同。比如Cry1Ca 和Vip3Aa对草地贪夜蛾表现为拮抗作用，而对小蔗螟表现为增效作用。

不同蛋白组合的增效作用是提高蛋白毒力的方法之一。评价混合蛋白的相互作用，利用启动子调控Bt杀虫蛋白的表达量，可以最大程度地提高转基因作物的抗虫作用，实现转基因作物与Bt生物资源的可持续利用。本研究结果将为中国的转基因玉米研发提供基础数据，促进转基因玉米的可持续应用。

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（責任编辑：田 喆）

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