肾移植术后早期BK,病毒感染的外周血淋巴细胞免疫特征分析

陈婷婷，朱冬，杨橙，王宣传，戎瑞明，朱同玉，李晓宇，王继纳

（1.复旦大学附属中山医院药剂科，上海 200032；
2.复旦大学附属中山医院泌尿外科，上海 200032；
3.上海市器官移植重点实验室，上海 200032）

BK 病毒（BK virus， BKV）是一种环状双链DNA 病毒，正常人群普遍易感，机体免疫力正常时并不表现出感染症状，而在免疫力低下的人群中，BKV 容易激活并大量复制，破坏肾小管上皮细胞并进入尿液甚至血液中［1］。BKV 感染是肾移植术后常见的病毒感染之一，BKV感染所致的BKV肾病 （BKV nephropathy， BKVN）已成为导致移植肾功能丢失的重要原因之一［2］。肾移植术后导致BKV 激活的原因有很多，主要与供者、受者以及肾移植手术本身、留置输尿管支架管、术后免疫抑制状态等因素相关［3］。其中，肾移植患者的过度免疫抑制状态是BKV 激活、复制及进展至BKVN 最主要的危险因素之一［4］。针对肾移植患者BKV 的感染，目前尚缺乏确切有效的临床治疗手段。因此，识别肾移植患者BKV 激活的危险因素和预警指标，尽早进行免疫状态的干预和调整，对于防治肾移植术后BKV 的感染和对移植肾功能的损害至关重要。

淋巴细胞是机体执行免疫防御的主要细胞，外周血淋巴细胞的特征在很大程度上反映了机体的免疫功能状态。在肾移植患者中，围术期的免疫诱导治疗可以通过阻断淋巴细胞的激活、信号转导和复制，导致患者外周血中淋巴细胞减少，并需要一定的时间来进行随后的免疫细胞重建［5］。研究表明，外周血中淋巴细胞的减少与肾移植术后病毒感染具有相关性，肾移植手术1 年后外周血淋巴细胞减少的患者更容易发生BKV 感染［5］，但少有研究探索肾移植术后早期淋巴细胞重建与BKV 激活的关系。有研究指出，淋巴细胞曲线下面积（area under the lymphocyte curve，L_AUC）是反映淋巴细胞重建的一个指标，并在异基因造血干细胞移植（allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）患者的研究中证实与术后病毒激活有关，可以作为造血干细胞移植后病毒感染的预测因素之一［6-8］。

因此，我们通过本项临床回顾性研究，来探究肾移植术后早期外周血淋巴细胞重建与BKV 激活的相关性，为临床上BKV 感染的预警及防治提供临床参考。

1.1 一般资料：回顾性收集2020 年1 月至2021 年10 月在复旦大学附属中山医院（以下简称“中山医院”）接受同种异体肾移植手术的164 例患者的临床资料。

纳入标准：首次接受肾移植；
行同种异体肾移植术前已签署知情同意书；
术后6 个月内定期进行血液和尿液中BKV-DNA 载量检测。

排除标准：年龄≤18 岁；
术后6 个月内发生急性排斥反应；
术后6 个月内发生严重感染（导致住院或住院时间延长）；
术后6 个月内失访、死亡；
术后6 个月内随访资料不完整，无相关实验室检查。

1.2 BKV-DNA 载量检测和外周血淋巴细胞监测：纳入本研究的患者均在术后6 个月内完成相应时间点的BKV-DNA 载量检测，在6 个月内采集晨尿和外周血标本，采用实时荧光定量PCR 检测。BKV尿症和BKV 血症的标准为实时荧光定量PCR 检测尿液中BKV-DNA 载量≥1×107copies/ml，血液标本中BKV-DNA 载量≥1×104copies/ml。以肾移植术后6 个月内发生BKV 尿症和/或BKV 血症的患者为BKV 激活组，术后6 个月内没有发生BKV 尿症或BKV 血症的患者为BKV 阴性组。

患者术后早期常规进行临床血常规检测，继而进行外周血淋巴细胞的监测。监测方案如下：术后1 周内，每天监测1 次；
术后1 周至出院时，每周一、周三、周五检测1 次；
出院后随访至术后30 d，每周监测1 次。

本研究所纳入的所有病例均通过中山医院电子病历系统回顾性收集患者的人口学特征和实验室检测数据，包括患者的性别、年龄、肾移植前透析方式，以及围术期免疫诱导方案、术后免疫抑制剂维持方案、术后中性粒细胞计数、直接胆红素、BKV检测时间、BKV-DNA 载量、肾移植术后的外周血淋巴细胞计数。本研究经中山医院伦理委员会批准（B2021-730R），所有纳入本研究的患者均签署知情同意书。

1.3 围术期免疫诱导及术后免疫抑制方案：纳入本研究患者的免疫诱导方案为巴利昔单抗（20 mg，D0、D4）或抗胸腺细胞免疫球蛋白（antithymocyte globulin， ATG）（总量2 ～3 mg/kg）。

纳入本研究患者的维持性免疫抑制方案为他克莫司或环孢素A + 吗替麦考酚酯或麦考酚钠 + 糖皮质激素三联免疫抑制剂维持方案，并根据药物的血药浓度及时调整药物的剂量。

1.4 外周血淋巴细胞重建指标——L_AUC：L_AUC定义为淋巴细胞计数-时间曲线下的一系列淋巴细胞计数之和［8］。本研究以L_AUC 作为淋巴细胞重建指数的标志，采用梯形法计算。对纳入研究的患者，分析了术后30 d 的淋巴细胞曲线下面积。同时，还比较了两组患者肾移植术前淋巴细胞计数的差异，及对两组患者进行术后淋巴细胞动力学研究，比较两组患者淋巴细胞计数的变化趋势。外周血淋巴细胞计数的测定由本院检验科采用阻抗法进行（日本sysmex 公司）。

1.5 统计学分析：采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均值±标准差（±s）表示，非正态分布的计量资料以中位数（四分位数）〔M（QL，QU）〕表示。正态分布计量资料采用t 检验或方差分析，非正态分布资料的组间比较应用非参数秩和检验。计数资料以频数和百分比表示，采用χ2检验进行统计学分析。应用多因素Logistic 回归法对混杂因素进行校正，筛选BKV 激活的危险因素。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 基本资料：根据纳入和排除标准对研究对象进行筛选，最终共纳入131 例肾移植患者，其中BKV 激活组40 例，均为BKV 尿症，其中有3 例患者血液中检测出BKV，但BKV-DNA 载量均＜1×104copies/ml，BKV 阴性组91 例。两组研究对象在性别上的差异具有统计学意义（表1）。

表1 研究对象的基本资料

2.2 淋巴细胞重建与术后早期BKV 激活的关系：比较了两组患者肾移植术前外周血淋巴细胞计数的差异（图1A），发现没有统计学意义（P=0.112），将其以淋巴细胞计数1 000 /μl 为界限分为淋巴细胞减低组和淋巴细胞正常组，进一步比较BKV激活组和BKV 阴性组术前淋巴细胞水平的差异（图1B），依然没有统计学意义（P=0.236）。

图1 BKV 阴性组和BKV 激活组术前淋巴细胞水平比较

两组患者的外周血淋巴细胞动力学研究如图2 所示，肾移植术后1 个月内，BKV 激活组的患者外周血淋巴细胞计数明显低于BKV 阴性组，通过t 检验分析显示，仅术后第1 天两组的差异具有统计学意义（P=0.003），而第7 天、第14 天、第21 天和第30 天，两组间的差异并不具有统计学意义。

图2 BKV 激活组和BKV 阴性组患者淋巴细胞动力学研究结果

进一步比较两组患者的术后30 d 的L_AUC（图3A），发现两组间差异具有统计学意义（P=0.03）。以中位数为界，将L_AUC ＜3 9750/μl 视为 术 后 低L_AUC，L_AUC ≥3 9750/μl 视 为术后高L_AUC，进一步比较术后淋巴细胞重建与BKV激活的相关性（图3B），发现两组间差异依然具有统计学意义（P=0.027）。

图3 BKV 阴性组和BKV 激活组术后30 dL_AUC 的差异性比较

2.3 同一DCD 供者的配对患者BKV 激活状况：131 例患者中，48 例患者分别接受了来自同一DCD 供者的2 个不同的供肾，将其配对分为两组（供肾1 组和供肾2 组）。对这两组患者进行BKV激活情况的亚组分析，探讨来自同一DCD 供者的配对患者的BKV 激活是否存在差异（表2）。

表2 来自同一DCD 供者的配对受体BKV 激活状况

在24 对接受同一供者的供肾患者中，7 对（29.2%）患者术后存在BKV 激活情况不一致，两组患者术后BKV 激活状况的一致性较差（Kappa检验，Kappa 值为0.373，P=0.058）。

2.4 影响术后早期BKV 激活的危险因素：对在单因素分析中P ＜0.25 的因素以及临床上可能导致患者肾移植术后BKV 感染的因素（如供肾类型、免疫诱导类型等）进行多因素Logistics 回归分析（图4）：结果显示，在对混杂因素进行校正后，肾移植术后L_AUC30是术后半年内BKV 激活的独立影响因素，低L_AUC30的患者术后BKV 激活的风险较高L_AUC30的患者增加了2.5 倍。模型的Omnibus 检验P=0.045，模型总体有意义，模型拟合优度检验Hosmer-Lemeshow 检验P=0.878，模型拟合优度高。

图4 肾移植术后早期影响BKV 激活的多因素回归分析结果

本研究探讨了常规监测外周血淋巴细胞计数对肾移植患者术后早期BKV 感染的潜在病因学作用，以术后半年内BKV 激活作为研究终点，探讨肾移植患者淋巴细胞与BKV 激活的相关性。研究结果显示，肾移植术后早期，BKV 激活的患者比BKV阴性的患者的淋巴细胞计数更低，在术后6 个月内，术后30 d 的淋巴细胞AUC ＜39 750/μl 的患者与同一时间点AUC ＞39 750/μl 的类似患者相比，有更大的BKV 激活风险。这一观察结果提示术后L_AUC 可能是肾移植患者BKV 激活的危险因素。同时，我们的结果也提示，术前淋巴细胞计数减少与术后BKV 激活没有明显相关性。

本研究结果与我们关于外周血淋巴细胞重建和BKV 激活风险相关的假设是一致的。肾移植围术期使用单克隆抗体或多克隆抗体进行免疫诱导治疗，可导致患者外周血淋巴细胞减少，抑制淋巴细胞增殖，而且需要较长的时间来进行淋巴细胞重建。免疫诱导方案的不同，也会导致淋巴细胞重建所需的时间不同。研究表明，使用ATG作为免疫诱导的患者，术后淋巴细胞重建更为缓慢，甚至可长达2 年之久［9］。在我们的研究对象中，在分析ATG 诱导和巴利昔单抗诱导患者术后的淋巴细胞计数水平和术后淋巴细胞AUC 后，也观察到使用ATG 诱导的患者，术后30 d 的L_AUC（26 911.11±7 365.4/μl）明显低于使用巴利昔单抗诱导的患者（44 702.05±20 451.2/μl）。但是进行单因素分析和多因素回归分析后，均未发现ATG诱导与术后BKV 激活有关，这可能是由于本研究仅纳入了9 例使用ATG 诱导治疗的患者，可能还需要更大的样本量。在对使用非ATG 诱导的患者进行亚组分析后，仍然发现术后30 d 的L_AUC 对BKV 激活有显著的影响。这个结果提示，肾移植患者术后30 d 低L_AUC 是独立于ATG 的BKV 激活的危险因素。

近年来，淋巴细胞与移植患者术后病毒感染的相关性研究已有报道。Dujardin 等［5］的一项对肾移植1 年后淋巴细胞减少与移植肾结局的研究发现，肾移植1 年后淋巴细胞持续减低的患者相较于淋巴细胞正常的患者，在特定的随访时间点，BKV感染的风险增加。Masutani 等［10］的研究表明，肾移植术后淋巴细胞计数下降可能是发生BKV 病毒血症的一个预测因素，Velioglu 等［11］的研究也观察到，发生BKV 肾病的肾移植患者可出现外周血淋巴细胞计数下降。以上研究均探讨了淋巴细胞计数与BKV 感染的相关性，但研究对象均为术后半年以上的患者。然而，BKV 感染大多发生在肾移植术后1 年内，尤以术后3 个月内最为多见［12］。因此，研究肾移植术后早期，尤其是半年内患者的淋巴细胞计数与BKV 感染的相关性，对于预警和防治BKV 感染可能更具有临床价值。

相比于某个单一时间点的淋巴细胞计数，连续监测外周血淋巴细胞计数可能更有助于预测肾移植术后的机会性感染［13］。我们的研究发现，术后BKV 激活组的患者术前的淋巴细胞计数水平低于BKV 阴性组，但是差异没有统计学意义。而且，在对肾移植患者进行术后淋巴细胞动力学研究后也发现，术后第7、14、21、30 天患者的外周血淋巴细胞计数均未显示出与BKV 激活的相关性，而只是术后第1 天的淋巴细胞计数与术后BKV 激活相关。进一步的分析发现，术后30 d 的L_AUC 与BKV 激活显著相关。这提示我们，与单一时间点的淋巴细胞计数相比，动态的淋巴细胞变化趋势对于BKV 激活的影响可能更大。

供肾因素是影响肾移植术后BKV 激活的因素之一。王军祥等［14］对99 例活体供肾移植患者和436 例DCD 供肾移植患者进行回顾性研究，发现DCD 供肾移植的患者术后尿液中BKV-DNA 载量＞1×107copies/ml 的2 年累积发生率明显高于活体供肾移植患者。然而在本研究中，未发现DCD 供肾与术后BKV 激活相关，这可能与本研究的样本量较小有关。但本研究通过对来自同一DCD 供者的不同供肾的受者术后BKV 激活状况进行分析后，发现同一供体的不同受体之间BKV 激活状况一致性较差。这可能可以进一步解释受体自身的免疫状态与BKV 激活相关，关注受体的免疫功能状况对于BKV 的防治意义更大。

肾移植患者的性别也是影响BKV 激活的危险因素之一［15］。在本研究中，除了外周血淋巴细胞重建的指标以外，男性也被确定为BKV 激活的危险因素，男性患者相比于女性更容易发生BKV 激活，这也与既往的其他研究结论相符。

本研究仍存在一定的局限性，包括本研究为单中心的回顾性研究，样本量较少，而且没有进行淋巴细胞亚群分析、动态监测淋巴细胞亚群与BKV感染的情况。我们还需更大型的多中心、多时间点的临床研究来探索淋巴细胞亚群重建与肾移植术后BKV 感染的关系，以进一步明确可预测、反映BKV 激活的淋巴细胞亚群。

综上所述，肾移植术后早期外周血淋巴细胞重建与肾移植术后BKV 激活具有相关性，术后30 d 低L_AUC 的患者更容易发生BKV 激活，淋巴细胞AUC可以用来识别肾移植术后BKV 激活的高风险患者。

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