探讨益木脑液灌肠对肝性脑病大鼠紧密连接蛋白及水通道蛋白表达的影响

刘昕艳 周振国 周烁 李京涛 常占杰 柏鲁宁

肝性脑病(hepatic encephalopathy ,HE)是各种急慢性肝病晚期常见的死亡原因。由于HE患者脑内无明显的异常结构变化，其发生难以提前预测。现代医学治疗本病除肝移植外，现仍以对症、支持治疗为主[1-2]，而中医以其独特的整体观念及辨证论治理论体系，在HE的治疗上取得了一定成果。益木脑液是笔者团队的常用方，具有通腑泻热、宣畅气机、醒脑开窍等功效，在临床应用中取得良好效果[3-4]。本团队前期研究发现益木脑液灌肠能够有效提高HE大鼠空间定位及学习等认知能力，但具体机制尚不明确[5]。既往研究发现, 血脑屏障受损和胶质淋巴系统功能障碍与大鼠认知功能障碍相关，且血脑屏障和胶质淋巴系统在大脑的代谢产物清除过程中起到互补作用[6]。紧密连接蛋白(tight junction protein occludin，Occludin)的表达与包括血脑屏障在内的多种屏障的通透性相关；
水通道蛋白4(recombinant Aquaporin 4，AQP4)的表达与脑内液体流动密切相关，是胶质淋巴系统重要组成部分，其变化可以影响大脑代谢产物清除。在此基础上，本实验采用 50% 的四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)联合硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)建立HE大鼠模型，观察益木脑液保留灌肠对HE大鼠血氨、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、血清天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)以及Occludin蛋白、AQP4蛋白表达的影响，探究其治疗肝性脑病的作用机制，以期为临床应用益木脑液治疗肝性脑病提供基础实验依据。

1.1 实验动物

SD大鼠72只，雄性，8周龄，体质量(210±20)g，购自成都达硕实验动物有限公司[许可证号: SCXK(川)2020-030]，于陕西中医药大学实验动物中心以正常光照节律及适宜湿度温度饲养，大鼠自由饮食、饮水及活动。适应性饲养7天。

1.2 试剂与仪器

益木脑液组方：生大黄 30 g、蒲公英 30 g、石菖蒲 30 g、乌梅 30 g、煅牡蛎 20 g、芒硝 20 g，中药购自陕西中医药大学附属医院中药房，将中药煎煮后浓缩为每克含生药8 g的冻干粉，冻干粉于4℃冰箱中密封冷藏保存，使用时100℃水溶解。

TAA(中国医药集团上海化学试剂有限公司，批号：YH21010802); CCl4(阿拉丁，批号：C128126)；
乳果糖(北京韩美药业有限公司，批号：20050005)；
血氨、ALT、AST试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为：A086-1-1, C009-2-1、C010-2-1)；
IL-1试剂盒(深圳海思安生物技术有限公司，货号：SZ-HAS-290)；
AQP4、Occludin、即用型SABC-POD试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为：ZP2011BP11、GR3243495-9、SA1022)。

仪器：包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5)，石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016)，酶标仪(雷杜生命科技有限公司，型号：RT-6100)，显微镜(Nikon公司，型号：E100)。

1.3 动物分组及造模

参考宋佰玉[7]的造模方法，建立肝性脑病大鼠模型。从72只SD大鼠中随机选取10只大鼠为对照组，其余62只大鼠为模型组。模型组按5 mL/kg给予 50% CCl4溶剂(50 mL橄榄油+50 mL CCl4)行腹腔注射，每周两次，根据体重变化调整剂量，共12周。第13周按 300 mg/kg给予3% TAA 溶液隔日行腹腔注射，隔天1次，连续2次，对照组大鼠给予等量橄榄油腹腔注射。若大鼠出现嗜睡、反应迟缓，自主活动减少、共济失调、昏迷等症状之一，可以判断造模成功。造模过程中，模型组大鼠死亡17只，对照组未出现死亡。将造模成功的45只SD大鼠随机分为模型组、乳果糖组和益木脑液低、中、高剂量组，每组9只。

1.4 药物干预

按照成人的用药剂量的200%、100%、50% 设置益木脑液高、中、低剂量组。乳果糖组按5.63 mL/kg 的剂量给予乳果糖灌肠，益木脑液低、中、高剂量组分别以 0.56 g/kg、1.12 g/kg、2.24 g/kg的剂量给予益木脑液灌肠，对照组及模型组给予等量蒸馏水灌肠，给药体积均按5 mL/kg计，灌肠后提起大鼠尾部并捏紧肛门，使大鼠倒置提起2～3分钟，防止液体漏出，使肠腔充分吸收，每日1次，连续给药2周。

1.5 取材方法

大鼠末次腹腔注射TAA后，禁食不禁水12小时，次日采用20%乌拉坦(1 g/kg)对大鼠进行麻醉，腹主动脉取血，血液一部分予以肝素钠抗凝，并在0.5小时内检测血氨水平；
剩余血液于4℃静置3小时后，以3000 r/min转速离心，取上清，冻存管分装，-80℃冰箱保存。脱颈处死大鼠，冰上取大鼠脑组织，4%多聚甲醛固定。

1.6 观测指标及检测方法

1.6.1 一般情况 实验期间每日观察各组大鼠精神状态、毛色、活动、体重及死亡情况并记录。

1.6.2 各组大鼠血氨和IL-1的表达水平 使用ELISA试剂盒检测IL-1和血氨的含量，比较各组大鼠IL-1和血氨表达水平，每个指标设置3次重复。

1.6.3 血清生化分析 将冷冻的血清样本回复至室温，振荡混匀，按照试剂盒说明书检测ALT和AST含量。比较各组大鼠ALT和AST表达水平，每个指标设置3个重复。

1.6.4 免疫组化检测Occludin蛋白和AQP4蛋白的表达 将大鼠脑组织石蜡包埋，切片，脱蜡，抗原修复，封闭，加入一抗孵育，加入二抗孵育，显色，复染，封片，于显微镜下观察。

1.7 统计学方法

2.1 各组大鼠一般情况

药物干预过程中，模型组大鼠死亡3只，乳果糖组死亡1只，益木脑液低、中、高剂量组各死亡2、1、1只。对照组大鼠体重增加稳定，饮食、饮水、活动、毛发、大小便均正常; 模型组大鼠造模后体重增加缓慢，逐渐出现饮食、活动减少、毛发枯黄稀疏、大便稀溏、尿黄，共济失调甚至昏迷。进行药物治疗的四组大鼠症状较模型组有不同程度改善，进食、活动增多，毛发逐渐光亮，共济失调、昏迷等情况好转，其中益木脑液高剂量组改善最明显，但与对照组相比仍有差异；
各治疗组大鼠体重虽有增加，但与模型组相比无明显差异。由于模型组大鼠剩余6只，故其他组随机取6组数据进行统计分析。

2.2 各组大鼠血氨、IL-1含量比较

与对照组相比，模型组血氨、IL-1水平均显著升高，且差异有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，乳果糖组和益木脑液各剂量组血氨、IL-1水平显著降低，且差异有统计学意义(P<0.05)；
与乳果糖组比较，益木脑液高剂量组血氨、IL-1水平显著降低，且差异有统计学意义(P<0.05)，且益木脑液各剂量组存在剂量相关性。见表1。

表1 各组大鼠血氨、IL-1含量变化

2.3 各组大鼠肝功能比较

与对照组相比，模型组ALT、AST水平均显著升高，且差异有统计学意义(P<0.05)，说明HE大鼠出现肝损伤；
与模型组相比，乳果糖组和益木脑液各剂量组ALT、AST水平显著降低，且差异有统计学意义(P<0.05)；
与乳果糖组比较，益木脑液高剂量组ALT、AST水平显著降低，且差异有统计学意义(P<0.05)，且益木脑液各剂量组存在剂量相关性。结果表明益木脑液可以保护肝细胞，改善HE大鼠的肝功能。见表2。

表2 各组大鼠肝功能变化

2.4 免疫组织化学染色观察益木脑液对肝性脑病大鼠Occludin蛋白和AQP4蛋白表达的影响

对照组Occludin蛋白均匀分布，沿细胞膜连续表达。与对照组相比，模型组褐色颗粒明显减少，染色较浅，表达分布不均紊乱。与模型组相比，乳果糖组、益木脑液各剂量组黄色、棕黄色或褐色颗粒明显增多，Occludin蛋白表达明显增强。见图1。

注：A 对照组；
B 模型组；
C 乳果糖组；
D 益木脑液低剂量组；
E 益木脑液中剂量组；
F 益木脑液高剂量组

对照组AQP4正常表达，呈棕褐或棕黄色。与对照组相比，模型组AQP4表达显著增多。与模型组相比，乳果糖组、益木脑液各剂量组黄色、棕黄色或褐色颗粒明显减少，AQP4表达减少。见图2。

注：A 对照组；
B 模型组；
C 乳果糖组；
D 益木脑液低剂量组；
E 益木脑液中剂量组；
F：益木脑液高剂量组

Occludin蛋白是血脑屏障紧密连接的关键组成部分，其在上皮屏障和血管内皮屏障中表达可以稳定屏障功能[8]，其表达降低可导致内皮细胞凋亡而影响屏障的通透性[9]，与多种疾病的发生、发展密切相关。血脑屏障是脑组织与血液、脑脊液进行物质交换的重要结构。Occludin蛋白下调和移位，使血脑屏障通透性增加，炎症因子和有毒物质从体循环进入大脑，损害神经元功能[10]。氨等有毒物质进入大脑，导致星形胶质细胞肿胀、神经炎症产生，从而造成血脑屏障功能障碍，形成恶性循环[11]。有研究表明，在肝病过程中，炎症因子IL-1表达增高，可降低Occludin蛋白表达，影响血脑屏障通透性，导致神经功能障碍，且氨与炎症因子起协同作用，可使神经元损伤，加重脑损伤，促使肝性脑病的发生[12-14]。本实验结果显示，模型组血氨、IL-1表达增多、Occludin蛋白表达减少；
益木脑液高剂量组血氨、IL-1表达降低、Occludin蛋白表达明显回升，提示益木脑液通过抑制炎症和调控Occludin蛋白的表达以改善血脑屏障功能。

血脑屏障与胶质淋巴系统在脑内废物运输和清除方面起互补作用，血脑屏障难以清除的远距离代谢产物可以通过胶质淋巴系统清除，胶质淋巴系统的调节可以提高血脑屏障清除率，二者可通过昼夜节律协同清除代谢产物[15]。胶质淋巴系统由血管周围间隙和主要表达于星形胶质细胞的AQP4蛋白组成，AQP4蛋白可以促进脑脊液和间质液的交换，并运输到静脉血管周围间隙，通过脑膜淋巴管进入颈深淋巴结，清除脑内可溶性蛋白和代谢产物[16]。AQP4蛋白表达上调时，可能影响AQP4蛋白极性，使脑脊液聚集于血管周围间隙，与间质液交换速度减慢，导致胶质淋巴系统清除能力降低[17]。星形细胞足突构成血脑屏障的最内层，其形态改变是神经炎症标志之一，AQP4蛋白表达增多，毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞肿胀，血脑屏障功能障碍[18]；
而炎症因子也影响脑脊液和间质液流动，代谢产物蓄积，损害胶质淋巴系统[15]。研究表明胶质淋巴系统清除功能受损可导致空间学习和认知障碍[19]。实验结果显示，模型组AQP4、IL-1表达增强，而益木脑液高剂量组AQP4、IL-1表达明显降低，提示益木脑液通过调控AQP4蛋白表达、减轻神经炎症以保护血脑屏障和胶质淋巴系统，促进脑内代谢产物清除，减轻脑损伤。

肝性脑病以意识障碍、行为失常、昏迷等为特征，笔者团队认为本病由于肝病日久，属本虚标实，病机为气虚血瘀、毒热瘀结，气机逆乱，上攻脑窍，遂为肝性脑病，由于下虚上实，因此本病不宜太过攻伐。益木脑液已在临床广泛应用，其安全性和有效性得到证明[3-4,20]，方中大黄具有抗炎、护肝、脑保护等作用[21]，大黄、芒硝相配可涤肠泻毒以通腑醒脑开窍，蒲公英清热解毒，三药配伍，则邪有出路，清浊自分，脑窍轻清；
石菖蒲开窍醒神；
煅牡蛎合乌梅可收敛涩肠止泻，以免太过攻伐而伤正。六药配伍，有升清降浊之效，起清热透邪解毒、醒神轻窍之功。本实验显示：模型组血氨、IL-1、ALT、AST水平显著升高，表明肝功能受损、炎症产生，而益木脑液组肝功能均有不同程度好转，血氨、IL-1水平均下降，表明益木脑液对肝脏具有保护作用。

综上所述，益木脑液可以改善肝功能，调控炎症因子，调节Occludin蛋白及AQP4蛋白的表达以改善血脑屏障通透性，改善脑功能，对肝性脑病起治疗作用。但本实验仍存在诸多不足，如未探究死亡大鼠的死因、只从单一机制研究益木脑液对大鼠的影响，而益木脑液作为中药复方，其设计是基于对肝性脑病病症的整体诊断，并非明确的单一作用机制，因此需要多方面研究，以更清晰地明确其作用机制。

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