人源GRK2的真核表达、纯化及活性检测

蒋励萍，陈露颖，蒯佳婕，王凤玲，李 浩，关艳玲，马 旸，韩陈陈，魏 伟

G蛋白偶联受体激酶 2(G protein-coupled receptor kinase 2, GRK2)属于丝/苏氨酸激酶，参与调节G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors, GPCRs)的磷酸化、脱敏和内化[1]。GRK2活性和表达的改变在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)等炎症免疫相关疾病中起着重要作用[2]。课题组前期研究[3-5]表明，GRK2与前列腺素E2受体4 (prostaglandin E2 receptor 4, EP4)结合，介导受体过度脱敏，导致RA中成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)的异常增殖和巨噬细胞极化。因此，GRK2可能通过调控与其结合的蛋白活性或表达，从而发挥多种生理和病理作用。

为了研究GRK2调控EP4的分子机制，本研究利用前期获得的GRK2野生型质粒，连接到高效真核表达载体pcDNA3.1-EGFP上，构建重组质粒。将重组质粒转染到HEK 293T 细胞中进行蛋白表达，通过 Ni-NTA 纯化及超滤获得 His-GRK2 重组蛋白。采用SDS-PAGE、Western blot、免疫共沉淀及His pull down等方法，鉴定GRK2重组蛋白的表达和生物活性，旨在为进一步研究GRK2蛋白对EP4的调控作用奠定基础。

1.1 实验材料

1.1.1细胞、菌株、载体 人胚肾HEK 293T细胞购自中国科学院上海细胞库；
pcDNA3.1-EGFP质粒、pIRES-EGFP-GRK2、pIRES-EGFP-EP4 质粒由本课题组前期构建和保存；
大肠埃希菌DH5ɑ 购自上海唯地生物技术有限公司。

1.1.2主要试剂 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM 培养基及PBS购自以色列BI公司；
Prime STAR酶、限制性内切酶Hind Ⅲ、限制性内切酶 BamH Ⅰ、T4 DNA连接酶、DNA Marker DL10000购自日本TaKaRa公司；
切胶回收试剂盒和质粒小提取试剂盒购自TIANGEN天根生化科技(北京)有限公司；
兔源GRK2、鼠源EP4购自美国Santa Cruz公司；
山羊抗兔和山羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
6FF琼脂糖凝胶微珠购自美国GE公司；
JetPRIME transfection reagent转染试剂购自法国PolyPlus公司；
考马斯亮蓝染色液购自上海碧云天生物技术有限公司；
PVDF膜和蛋白超滤管(截留30～50 ku蛋白)购自美国Millipore公司。

1.1.3主要仪器 T100TMPCR 仪购自美国 Bio-Rad公司；
核酸电泳仪和 DYY-6C 型电泳系统购自北京六一公司；
Scientz-IID 超声波细胞粉碎机购自南京赛飞生物科技有限公司；
Tanon 1600全自动数码凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；
ImageQuant LAS 4000荧光及化学发光成像系统购自美国GE公司。

1.2 方法

1.2.1引物设计、合成及PCR扩增 从 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ 网站获取人源 GRK2 基因序列(NM 001 619.5)，设计并添加Hind Ⅲ 和BamH Ⅰ 酶切位点和C端6×His标签(CATCATCACCATCACCAT)的引物扩增全长约为2 067 bp的GRK2基因，上游引物：5′-CCCAAGCTTATCCACCTGACCATGAATG-3′ (下划线部分是Hind Ⅲ 酶切位点)，下游引物：5′-CGCGGATCCATGGTGATGGTGATGATGGAGGCCG-3′ (下划线部分是BamH Ⅰ 酶切位点，加粗是6×His标签)，所有引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。PCR反应体系 (50 μl)：cDNA 1 μl、上游引物 1 μl、下游引物 1 μl、Prime Star DNA 聚合酶 0.5 μl、dNTP 4 μl、5×Prime Star buffer 10 μl、H2O 32 .5 μl。反应程序如下：30个循环(98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min) 进行扩增。将PCR产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳，出现约2 067 bp 的条带时利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收产物。

1.2.2pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重组真核表达质粒的构建及双酶切鉴定 将His-GRK2 的PCR产物回收片段与pcDNA3.1-EGFP 质粒，37 ℃，Hind Ⅲ 和BamH Ⅰ 双酶切2 h，产物分别经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收试剂盒回收产物。用T4 DNA连接酶在4 ℃条件下连接 His-GRK2 基因片段回收产物与pcDNA3.1-EGFP 回收产物 12 h。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化液涂板，37 ℃培养12～16 h，挑取菌落摇菌培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒。

1.2.3pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重组真核表达质粒的测序验证 挑选重组质粒，经 Hind Ⅲ 和BamH Ⅰ 双酶切鉴定为阳性克隆后送至南京擎科生物科技有限公司进行测序，以载体的通用引物进行测序鉴定。测序结果利用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov网址进行测序比对。

1.2.4细胞培养与pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重组真核表达质粒的转染 细胞准备：人HEK 293T细胞以每孔1×106个细胞接种于6孔板中，以10% DMEM 培养液培养，置于37 ℃、5 % CO2箱中孵育24 h，至细胞达到80%～90%融合进行转染。

转染方法(6孔板)：① 制备转染复合物：取无菌1.5 ml EP管，加入200 μl的jetPRIME buffer，再加入2 μg DNA，快速涡旋10 s，混匀后，加入4 μl的jetPRIME reagent转染试剂，快速涡旋10 s，混匀后室温静置10 min。② 转染：将6孔板中培养基弃去，加入2 ml 10%DMEM，将转染复合物加入孔中，将其置于37 ℃、5% CO2孵箱内培养48 h，观察转染效果。

1.2.5倒置荧光显微镜观察pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2转染效率 HEK 293T细胞转染pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒后(带有EGFP标签)，培养48 h，在倒置荧光显微镜下观察GRK2的转染效率并拍照。

1.2.6Western blot鉴定GRK2蛋白在细胞中的表达 HEK 293T细胞转染pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒48 h后，加细胞裂解液冰上裂解30 min，提取蛋白，BCA蛋白定量后，加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮沸10 min，Western blot检测蛋白表达情况。

1.2.7His-GRK2重组蛋白的纯化和鉴定 将GRK2真核重组质粒转染至HEK 293T细胞，培养48 h后，收集细胞，加入蛋白裂解液，通过细胞破碎仪破碎细胞，4 ℃条件下，13 400 r/min离心15 min，收集蛋白上清液，将蛋白上清液与6FF琼脂糖凝胶微珠，4 ℃摇床孵育2 h，离心收集微珠，4 ℃条件下，蛋白洗液(含20 mmol/L 咪唑)洗涤3次，30 min/次，离心收集微珠，4 ℃条件下，蛋白洗脱液(含300 mmol/L 咪唑)洗涤3次，30 min/次，分别收集3次洗脱蛋白(第1次洗脱蛋白、第2次洗脱蛋白、第3次洗脱蛋白)，将3次洗脱蛋白加入5 ml超滤管(截留蛋白30～50 ku)离心，收集蛋白，加入蛋白置换液(低盐蛋白缓冲液)于5 ml超滤管，进行离心，置换蛋白缓冲液，得到脱盐后的蛋白，通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测3次洗脱蛋白和脱盐后蛋白的表达。

1.2.8His pull down 检测GRK2蛋白的活性 本研究前期已成功构建 pIRES-EGFP-EP4 质粒，将与GRK2真核重组质粒分别转染HEK 293T细胞，收集转染后的细胞，加入蛋白裂解液，通过细胞破碎仪破碎细胞后，4 ℃条件下，13 400 r/min离心15 min，将带有His标签的GRK2与6FF琼脂糖凝胶微珠，4 ℃摇床孵育2 h，离心收集微珠，4 ℃条件下，蛋白洗液(含20 mmol/L 咪唑)洗涤3次，30 min/次，离心收集微珠。将过表达pIRES-EGFP-EP4的蛋白与处理的微珠4 ℃摇床孵育12～16 h。离心收集微珠，加入20～30 μl的蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min，Western blot检测GRK2与EP4的共表达。

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 8 软件进行统计学处理，实验数据以均数±标准误(SEM)表示。采用t检验比较两组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重组质粒的构建利用设计的引物以pIRES-EGFP-GRK2基因为模板，利用合成引物进行PCR扩增 His-GRK2目的基因全长，进行1%琼脂糖电泳。凝胶成像系统检测发现，线性His-GRK2目的片段位置在2 067 bp左右(图1A)。将PCR产物进行1%琼脂糖电泳，切胶回收产物。将PCR回收产物与pcDNA3.1-EGFP空载体通过Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行双酶切，酶切产物通过T4 DNA连接酶进行连接，构建pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒，双酶切鉴定结果表明，在 2 067 bp左右出现线性His-GRK2目的片段，在6 154 bp左右出现线性pcDNA3.1-EGFP目的片段，提示pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒成功构建(图1B)。同时随机挑选1个酶切鉴定阳性的质粒进行测序，并对测序结果进行拼接，利用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov网址进行测序比对，发现 GRK2 standard Seq 与测序结果一致，pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重组质粒未发生突变，测序序列对比未出现异常，说明 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2 重组质粒成功构建(图1C)。

图1 人源GRK2基因PCR扩增、酶切鉴定和测序

2.2 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2蛋白成功表达HEK 293 T细胞以2×106个/孔细胞密度接种于6孔板中，转染pcDNA3.1-EGFP-ctr和pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重组质粒，培养 48 h后，在倒置荧光显微镜下观察转染效果，可见绿色荧光蛋白(EGFP标签)的表达，pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒转染效果达到60%以上(图2A)。收集转染后的细胞，细胞裂解液冰上裂解30 min，Western blot用于检测GRK2重组蛋白的表达，结果表明pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2在HEK 293 T细胞中过表达(t=6.433,P=0.003)(图2B)。

图2 Western blot检测GRK2蛋白表达

2.3 表达和纯化获得His-GRK2重组蛋白HEK 293T细胞转染 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2 质粒后，裂解蛋白，加入 6FF 琼脂糖凝胶微珠孵育后。加入1 ml蛋白洗脱液(高盐)，洗脱蛋白进行超滤，得到 500 μl 蛋白溶液。考马斯亮蓝染色检测GRK2蛋白纯化效果见图 3A，Western blot 检测 GRK2 蛋白表达结果见图3B。结果表明，考马斯亮蓝染色和Western blot检测均可以在80 ku左右检测GRK2阳性蛋白表达。

图3 考马斯亮蓝染色和Western blot分析GRK2蛋白的表达和纯化

2.4 GRK2结合EP4HEK 293T细胞转染pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒，同时转染pIRES-EGFP-ctr和pIRES-EGFP-EP4质粒，裂解蛋白后，与结合His蛋白的镍珠共同孵育，处理后的蛋白样品沸水煮10 min，Western blot检测EP4蛋白的表达。结果表明，过表达EP4可以促进GRK2与EP4的结合(t=13.5,P=0.000 2)(图 4)。

图4 His pull down 检测GRK2与EP4的结合能力

GRK2由689个氨基酸(amino acid, aa)组成，具有3个重要的结构域：氨基端(1-185 aa)、激酶活性区(186-513 aa)和羧基端(514-689 aa)[6]。GRK2的氨基端具有一个G 蛋白信号同源域调节(regulator of G protein signaling homology, RH)区，通过结合Gβγ等蛋白发挥转膜功能[7]。GRK2激酶活性的改变是GRK2发挥多种生理和病理功能的重要条件，有研究[8]表明220位的赖氨酸(Lys, K)是决定GRK2激酶活性的关键氨基酸位点，Lys220突变为精氨酸(Arg, R)可使GRK2激酶活性丧失。GRK2的羧基端具有RH区和 Pleckstrin同源(Pleckstrin homology, PH)区，有利于其亚细胞定位和激动剂依赖的转膜，可以与游离Gβγ亚单位、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)等蛋白结合[9-10]。目前已有许多研究表明GRK2表达和活性的改变与疾病的发生相关，如GRK2表达和活性增加在高血压、心衰以及RA的发生和发展中起着重要作用，而GRK2的表达和活性的降低与肝癌、多发性硬化症等疾病的发生密切相关[11]。这些研究结果提示，GRK2的活性维持在一个平衡状态是研究GRK2活性调节剂的主要方向。现已有多种GRK2活性调节剂被尝试用于治疗心力衰竭、RA等疾病，其中帕罗西汀、Gallein、GSK180736A等已经进入动物试验阶段[12-13]。

本实验在GRK2的羧基末端引入了6×His (CATCATCACCATCACCAT)的短肽是蛋白纯化常用的标签。目前常用于蛋白纯化的标签蛋白包括His、Myc、Flag、GST等标签，但Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白质的活力，所以较少用于纯化蛋白，Flag重组蛋白的纯化成本较高，GST标签纯化成本低但增溶能力一般。His 标签相较于Myc、Flag、GST等标签具有以下优势：① 标签蛋白非常小，不会影响目的蛋白质本身的结构；
② 不会影响目的蛋白自身的活性；
③ 便于采用固化金属离子亲和层析；
④ 操作方便，纯化蛋白成本低。本实验选择pcDNA3.1-EGFP真核表达载体构建His-GRK2真核表达重组质粒，这与原核表达体系相比，虽然不能一次性获得大量的蛋白，但具有以下优势：外源性真核表达特异性强，具有翻译后加工修饰功能，使其结构、糖基化方式更接近天然蛋白，具有高活性。

获得有活性的GRK2蛋白是进一步研究其功能和作用机制的前提。本研究通过设计引物，利用PCR扩增技术得到带有His标签的GRK2基因，并采用分子克隆手段将GRK2基因连接到pcDNA3.1-EGFP真核表达载体上，成功构建pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒，通过酶切鉴定和测序结果证明pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2构建成功。再利用瞬时转染技术将其转染入HEK 293T中，通过Western blot及考马斯亮蓝染色验证GRK2在真核细胞293T中正确表达。通过His pull down 的方法鉴定出GRK2与EP4的相互作用，具有生物学活性，为后续研究GRK2的作用机制奠定了基础。

猜你喜欢微珠真核琼脂糖空心微珠负载铈或氮掺杂氧化亚铜光催化剂的制备方法牡丹江师范学院学报（自然科学版）(2022年4期)2022-11-21硅酸铝微珠在人造花岗石中的应用石材(2022年1期)2022-05-23基于胶原-琼脂糖的组织工程表皮替代物构建研究太原理工大学学报(2021年6期)2021-11-25人源肾细胞(HEK293T)蛋白LGALS1真核表达载体的构建现代畜牧科技(2021年8期)2021-10-13真核翻译起始因子-5A2在肝内胆管癌中的表达及意义昆明医科大学学报(2021年5期)2021-07-22水乳化法制备罗丹明B接枝琼脂糖荧光微球❋中国海洋大学学报（自然科学版）(2019年7期)2019-05-21水乳化法制备罗丹明B接枝琼脂糖荧光微球❋中国海洋大学学报（自然科学版）(2019年7期)2019-01-04琼脂糖以及高分辨率琼脂糖制备方法研究进展*广州化工(2016年11期)2016-09-02塑料微珠缘何被日化用品拒之门外？现代塑料(2016年11期)2016-02-09空心玻璃微珠/PNHMPA/PEG复配保温蓄热乳胶漆的制备与表征大连工业大学学报(2015年4期)2015-12-11

推荐访问:纯化 活性 表达