土壤多环芳烃污染生物表面活性剂强化修复的研究进展

姚丹丹，王辉，田坤，王宁，代威，程功弼，刘云

(1.中国科学院南京土壤研究所 土壤环境与污染修复重点实验室，江苏 南京 210008；
2.中国科学院大学，北京 100049；
3.江苏盖亚环境科技股份有限公司，江苏 苏州 215000)

随着工业的快速发展，化石燃料的快速消耗和生物质燃烧导致多环芳烃(PAHs)在水土等环境中积聚并且造成环境污染，严重威胁到生态安全及人类健康。由于生物修复技术具有良好的社会、生态综合效益，在PAHs污染土壤修复中具有广阔的应用前景[1]。然而，由于PAHs水溶性低，导致生物修复技术对土壤中PAHs降解效率不高，表面活性剂强化修复技术(SER)可提高PAHs生物利用度，从而提高PAHs污染土壤的修复效果。相较于化学表面活性剂，生物表面活性剂由于其优良的表面活性和绿色低毒的优势被广泛应用在SER中，逐步成为土壤修复领域的热点。

本文总结了生物表面活性剂增强土壤PAHs微生物、植物以及微生物-植物联合降解技术，介绍了生物表面活性剂的性质和强化生物降解PAHs性能及降解机制；
讨论了生物因素和非生物因素对生物表面活性剂强化降解PAHs性能的影响，并指出SER目前存在的技术缺陷和研究热点方向。

世界人口的迅速增长及工业和人为活动的激增，致使环境中有毒污染物浓度呈指数上升[2]。PAHs是由两个或两个以上苯环结构构成的一类疏水性有机化合物，产生途径大致分为4种：①石油(来源于燃料)；
②热解(来源于不完全燃烧)；
③生物(通过有机代谢产生)；
④成岩作用(通过转化过程产生)[2]。我国与亚洲其他国家PAHs污染水平相当，高于南美洲、大洋洲和非洲，低于北美洲[1]，但我国土壤受PAHs污染整体形势依旧严峻，北方等重工业地区表层土壤中PAHs含量高于南方地区，城区表层土壤中PAHs含量高于农村，且近年来呈现出由城市向农村逐渐扩散的趋势。由于PAHs具有高辛醇水分配系数易吸附在土壤颗粒上，使PAHs具有较低的生物有效性，不易被微生物降解，特别是高分子量多环芳烃(HMW PAHs)能够长期在土壤环境中累积，给生态系统和人类健康造成了严重威胁。

生物修复技术是指利用生物(动、植物和微生物)代谢与富集能力实现污染物矿化的过程。

动物修复是指利用蚯蚓等清除污染土壤中的污染物。蚯蚓可以通过间隙水中的潮湿“体壁”“吸收”溶解PAHs，也可以在土壤通过肠道时通过嘴“摄入”经由肠道降解[3]。蚯蚓还可以通过排泄容易降解的碳来刺激微生物的活性并促进其生长，从而实现PAHs的降解。土壤动物修复也有一些限制，如蚯蚓生存需要适宜的条件，且只对轻度污染的土壤有效，极端的温度会使蚯蚓的存活率降低。

植物修复是基于植物多种过程进行的环境修复技术，包括植物积累、植物吸收、植物固定、根际降解等。Na等[4]通过盆栽试验研究羊茅(火凤凰)对污染土壤PAHs的降解能力，150 d后发现PAHs去除率为68.29%。此外，玉米对土壤中PAHs的去除也有较好效果，60 d的室内盆栽试验使土壤中10～100 mg/kg芘的降解率达81.19%～89.13%，并且提高了玉米根际土壤中脱氢酶和脲酶的活性[5]。但植物修复技术易受气候及地质条件等因素限制，对高浓度或深层PAHs污染土壤的修复效果不佳。

微生物修复是利用微生物将PAHs转化为CO2、H2O或其它小分子化合物的过程[6]。细菌是土壤微生物中占比最大和最活跃的一类微生物，大多数通过自身固有的胞内酶如加氧酶、二羟基酶等代谢PAHs。真菌则可同时利用胞外和胞内的降解酶降解PAHs[7]，并且，当苯并[a]芘单独或与邻苯二甲酸、琥珀酸钠等作为共代谢底物时，在降解菌分泌的木质素降解酶等酶类作用下，苯环会断开分解为琥珀酸、丙酮酸及乙醛等[8]。虽然微藻对PAHs的生物降解研究相对较少，但有研究发现当藻类与细菌联合对PAHs的降解效果较为明显[9]，这是由于藻类既可以通过光合作用提供O2给好氧细菌，有利于矿化PAHs并吸收释放CO2，还可以协助共代谢降解、产生生物表面活性剂或其他代谢产物，提高细菌的活性和PAHs的生物利用度。综上，生物修复通过自然过程将有害的PAHs转化为毒性较低的化合物，解决了传统修复方法的缺点。

虽然大量的研究已证明生物修复能够有效去除土壤中PAHs，然而，由于PAHs溶解度低，且容易吸附到土壤中，致使生物修复技术难以达到预期效果。为了解决上述限制，研究人员采用表面活性剂作为增溶剂，提高PAHs的生物可利用性。但是随着研究的进一步深入，人们发现合成表面活性剂对生物具有较大毒性和抑制作用，这些毒副作用限制了合成表面活性剂在SER中的应用。

3.1 生物表面活性剂的研究进展

3.1.1 生物表面活性剂的性质 生物表面活性剂是由植物或微生物产生的具有两亲性的代谢产物，具有乳化、发泡和分散特性，被广泛应用于化妆品、石油、农用化学品和化肥等多个领域[10]。与合成表面活性剂相比，生物表面活性剂在PAHs污染土壤的修复领域具有更大的潜力。首先，生物表面活性剂分子结构复杂多样，具有较高的表面活性和乳化特性。Shi等[11]利用铜绿假单胞菌制备的脂肽，可将PAHs乳化成微小颗粒，提高PAHs在水相中的生物利用度。其次，生物表面活性剂易降解和毒性低，毒性通常比合成表面活性剂低几十甚至百倍[12]。鼠李糖脂在好氧时降解率达74%，而TritonX 100在好氧时只有轻微降解[13]。此外，生物表面活性剂还具有较宽的pH、温度和盐度适用范围[14]。Shavandi等[14]证实，由红球菌产生的胞外脂和糖脂在高盐度(NaCl 10%)、高温(120 ℃)、较宽的pH值范围内(2～12)仍然保持较高的活性和稳定性。

临界胶束浓度(cmc)和亲水亲脂平衡(HLB)是表征生物表面活性剂性质的重要参数。在较低的浓度下，生物表面活性剂以单体的形式在空气/水和油/水界面上排列有序，随着浓度的增加疏水基团相互吸引开始聚集形成胶束[15]，此时表面活性剂浓度称为cmc，且其增溶性、电导率、光散射强度等物理性质也会发生变化[15](图1)。HLB是衡量生物表面活性剂亲水性或亲脂性的指标。增溶效果随HLB值增加而增加，HLB值较低说明生物表面活性剂是亲脂性的，HLB值较高说明水溶性较好[15]。

图1 生物表面活性剂浓度与表面张力、 界面张力和PAHs溶解度的关系[15]Fig.1 Relationship between biosurfactant concentration and surface tension，interfacial tension and solubility of PAHs

3.1.2 生物表面活性剂的来源与分类 生物表面活性剂的来源、类型及应用见表1。

表1 常见的生物表面活性剂的来源、类型及应用Table 1 Sources，types and applications of common biosurfactants

按照其结构特征可分为糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、中性脂以及聚合物表面活性剂等；
按照分子量分为低分子质量(糖脂、磷脂)和高分子质量(脂多糖、脂蛋白)。目前，应用较为广泛的是微生物源鼠李糖脂和槐糖脂。鼠李糖脂是国内最早研究并成功产业化的生物表面活性剂，HLB值为22～24。槐糖脂是由假丝酵母菌以糖和植物油等为碳源，经一定条件的发酵产生的微生物次级代谢产物[26]，主要有内酯型和酸型两种结构类型。鼠李糖脂和槐糖脂性能相近，槐糖脂分子量较大，属低泡型表面活性剂，更适用于工业和民用清洗、化妆品等领域。与微生物源表面活性剂相比，植物源表面活性剂更易于生产，可从500多种植物的根、茎和叶中提取[27]，其中被广泛研究的一类为皂苷，皂苷的疏水基团由三萜或甾体骨架组成，亲水性基团由几个糖类残基组成，然后通过糖苷键连接到疏水支架上，这种特殊的两亲结构赋予了皂苷良好的乳化特性和更低的cmc值[27]，使其拥有更优良的增溶洗脱特性。

3.2 生物表面活性剂强化微生物修复

PAHs降解功能细菌通常具有特殊的细胞结构，含有更多的核糖体，PAHs可以在细胞质膜上积累，并且合成磷脂的能力更强[28]。引入生物表面活性剂可以增加溶解态PAHs和微生物表面疏水性，从而强化PAHs生物降解。有一类细菌同时拥有代谢PAHs和分泌出生物表面活性剂的能力。Nie等[29]从污染场地土壤中分离到一株可产生10余种新型鼠李糖脂的PAHs降解菌，在1.5 h之内就可降解多种PAHs。单个菌株通常难以达到较好的降解效果，构建两种或以上的微生物混合菌群也是近年来研究的热点。Makkar等[30]构建的人工菌群可以生产两种新型脂肽，并可将PAHs完全降解。

真菌具有在广泛生境和极端环境条件下存活的能力，因此被认为是一类PAHs潜在的降解菌[31]。白腐真菌能够分泌木质素过氧化物酶(Lip)、漆酶(Lac)和锰过氧化物酶(Mnp)等，可以高效快速地降解PAHs[31]。Lip、Lac和Mnp通过单电子攻击形成自由激发态羟基，再氧化PAHs形成醌可直接开环而被矿化，随后进入三羧酸循环(TCA)，最后矿化为CO2与H2O[31]。生物表面活性剂的存在对真菌的生长具有特异性的调节作用，可以提高真菌可溶性底物的生物利用度、刺激真菌孢子的生长和运输。除了真菌的生长外，生物表面活性剂对分泌的木质素分解酶和氧化酶的活性也有调节作用[32]。彩绒革盖菌在PAHs和鼠李糖脂的存在下，可刺激多种酶(漆酶、芳醇氧化酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶)的分泌，最终促进PAHs高效降解[32]。

3.3 生物表面活性剂强化植物修复

生物表面活性剂与植物联用可以增加土壤中有机碳的含量、刺激微生物活性并增强植物根际污染物的降解，被越来越多地应用在PAHs污染土壤修复中(表2)。Liao等[33]通过盆栽试验证实了鼠李糖脂和Tween 80能够促进玉米根系对PAHs的积累，植物的根系分泌物也可能与鼠李糖类相互作用增强PAHs的扩散作用。据报道，植物内生菌能够在PAHs污染场地中产生生物表面活性剂，促进植物在胁迫条件下的生长，提高土壤酶活性，降低PAHs的毒性作用[34]。另外，内生菌比根际或土壤细菌具有更强的植物修复PAHs的能力[34]。适当的植物和内生菌组合能够更好地促进植物的生长，植物为内生菌提供了营养丰富的栖息地，从而使它们免受外界胁迫，促进植物体内或根际PAHs的生物降解。

表2 PAHs土壤污染的生物表面活性剂强化植物修复实例Table 2 Examples of biosurfactant-enhanced phytoremediation of PAHs soil pollution

3.4 生物表面活性剂强化植物-微生物联合修复

植物对PAHs的去除能力相对较差，而微生物在降解PAHs过程中发挥着关键作用，因此在实际土壤污染中向植物根际接种高效降解菌株是一种提高PAHs去除效果的有效方法(图2)，PAHs的增溶洗脱是前提，微生物降解或植物吸收积累是关键。植物根系除了为微生物在土壤中的定殖提供了微环境，还可以提供大量可溶性有机物和次生植物代谢物，从而强化降解根际区域的PAHs[41]。真菌和细菌在PAHs降解过程中起着协同和互补的作用，真菌能够刺激HMW PAHs的初始降解反应，细菌则主要对其代谢产物起作用[41]。具体的协同降解途径是在P450单加氧酶的作用下，PAHs经过真菌代谢生成反式二氢二醇，再经脱氢酶催化进一步转化为二醇产物[42]，最终在细菌分泌的酶催化下转化为CO2和H2O。PAHs的消解过程中植物富集作用贡献较小，Zheng等[43]利用烷基糖苷、三叶草与枯草芽孢杆菌组成的联合体系计算了芘消解的贡献率，三者协同作用的贡献度为32.12%，植物富集的贡献度极小(<0.3%)。

图2 生物表面活性剂强化植物-微生物联合修复PAHs污染土壤的过程Fig.2 The process of biosurfactant-enhanced plant-microbe symbiotic remediation in PAHs-contaminated soil

3.5 强化生物修复的影响因素

生物修复受污染物吸附/解吸过程、微生物活性、代谢产物等影响。因此生物表面活性剂强化生物修复的效果取决于以下几个因素，包括植物和微生物特征等生物因素以及生物表面活性剂浓度、PAHs的结构和理化性质、环境因素等非生物因素。

3.5.1 生物因素 不同的植物种类转化和吸收PAHs的能力不同，禾本科牧草对PAHs的去除能力优于草本植物[44]；
植物对不同PAHs的去除和转化存在差异，HMW PAHs具有很强的生物蓄积能力，在植物中的运输能力较差，因此，易积累在植物的根系；
不同植物根系分泌物对PAHs的去除能力也不同。微生物种类和组合对PAHs降解能力也存在差异[41]，不同的细菌与真菌组合会存在协同或抑制作用[41]。土著微生物、噬菌体和原生动物的存在也是至关重要的，它们与降解微生物竞争营养，可能成为降解微生物的掠夺者[41]。

3.5.2 非生物因素 生物表面活性剂浓度是非生物因素中常见的指标，低浓度(cmc)有时会通过在植物根际或微生物周围形成保护层，从而削减真菌降解PAHs的有效性。而过高浓度往往还会影响PAHs降解酶的稳定性，导致修复效率降低[45]。

PAHs自身的结构、物理和化学性质是非生物因素中另一重要指标。随着PAHs环数增加其溶解度逐渐减低，因此，对于HMW PAHs需要更多的生物表面活性剂投加量。不同PAHs对植物和微生物的毒性作用也不同，植物对分子量较小的PAHs具有较好的降解能力，但对HMW PAHs降解能力较差。降解过程中PAHs组分间也可能相互作用，改变混合物生物降解的速率和程度。虽然多底物会提高PAHs的整体生物利用率，但各种PAHs间存在竞争抑制现象，当菲和芘共存时芘的降解会被抑制[46]。

环境因素对PAHs修复具有多方面影响。首先，水分直接影响土壤中的氧含量，这对细菌、真菌活性及植物生长发育至关重要。土壤表面过于致密，对好氧微生物的生存产生抑制作用，土壤颗粒与PAHs紧密地结合在一起，不利于植物的生长；
其次，土壤质量的差异也会影响PAHs的降解。研究表明，在土壤中添加N、P等养分能促进土壤中细菌和真菌的活性，特别是有助于低分子量多环芳烃(LWM PAHs)的氧化和分解，但对HMW PAHs的去除影响不大[47]。

3.6 强化生物修复机制

生物表面活性剂强化PAHs降解的主要机制有两种：一种是动员作用，即促进PAHs的迁移，促使其与微生物细胞充分接触。根据相似相溶性原则，生物表面活性剂单体的疏水基团倾向于附着在PAHs上，亲水性基团更倾向于水相，单体在油水界面上的积累降低了界面张力。同时，疏水端吸附在PAHs表面，并沿两者界面缓慢渗透扩散形成亲水吸附层[48]，改变固体表面的润湿性，在水力作用下PAHs被迁移至水相中，微生物会更快地获得生长所需的底物。

另外一种主要机制是通过增溶作用，即通过生物表面活性剂乳化PAHs提高其溶解度，同时调节微生物细胞与PAHs间的相互作用，改变微生物表面性质，最终影响PAHs的生物降解速率和降解过程。一般情况下，生物表面活性剂浓度只有超过cmc点形成胶束时才能起到增溶作用。根据分配原则，胶束的疏水中心也可以在PAHs或土壤上争夺疏水污染物的分配，PAHs在水溶液中通过分配作用转移到胶束中。因此，当PAHs分配到疏水中心时，它们的溶解度就会增加。Brown[49]将污染物的表观水溶性解释为水相(Caq)和胶束相(Cmic)中污染物的浓度之和，Edwards[50]进一步确定胶束相污染物浓度可以用一种线性分配关系来模拟：

Cmic=kmicSmicCaq

其中，kmic是PAHs-胶束的分配系数，S是胶束浓度，Smic是表面活性剂总浓度与其cmc的差值。

生物修复技术是目前PAHs污染土壤治理最具应用和发展前景的绿色修复技术，但由于修复时间长、修复效率不高等缺点，限制了该技术的产业化应用。生物表面活性剂因具有可生物降解性、生态安全性和环境可接受性等特点，与生物修复技术联合修复PAHs污染土壤引起研究者的兴趣。然而，其高生产成本限制了其在生物修复过程中的应用。因此，有必要寻找经济可行的大规模生产工艺。另外，生物表面活性剂可以通过与其他表面活性剂的复配方法降低修复成本，但需要考虑具体的实际污染状况等多方面的因素。今后生物表面活性剂强化生物修复技术的研究还应考虑以下几个方面。

(1)目前生物表面活性剂强化生物修复机制还不深入。因此，结合盆栽试验和实际污染土壤修复场地，可从微观机理和宏观现象等多角度揭示生物表面活性剂强化微生物或植物对PAHs降解规律、代谢机制以及在实际土壤基质修复中应用的可行性，并结合环境基因组学技术，从基因层面揭示生物表面活性剂-微生物-植物对PAHs的降解机制。

(2)过去PAHs污染土壤修复的研究主要依靠单一手段，今后应结合不同的PAHs污染状况、土壤类型、生物表面活性剂种类、微生物或植物等生物和非生物因素，设计一种最佳的生物表面活性剂-微生物-植物-目标土壤环境组合，以实现生物表面活性剂强化PAHs污染土壤的修复和大规模应用。

(3)构建PAHs污染土壤高效降解功能菌群，发挥功能微生物在PAHs污染修复中的高效降解作用。由于此类菌株源于受污染的环境基质，对PAHs具有潜在的降解能力，使微生物的弹性、稳定性、抗逆性和多功能等特性显著增强。

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