一例貉源细小病毒病的诊断与防治

伊 惠，曹 兵

（1.山东省泰安市畜牧兽医事业发展服务中心，山东泰安 271000；
2.滕州市畜牧渔业事业发展中心，山东枣庄 277500）

貉细小病毒可以引起貉出现严重的肠炎症状，包括呕吐、排血样粪便、精神沉郁、厌食等。在幼貉群体中常常出现地方性流行的特点，而在成年貉群体中感染后呈现多种隐性或慢性感染。该病在每年的6—9月多发，主要的传染源为患病貉，即使康复后自身携带免疫力，仍然可以向环境排毒，健康貉通过呼吸道和消化道感染。1988 年，夏咸柱等[1]在不同地区分离鉴定了3 株貉细小病毒，首次证实了我国存在貉细小病毒。近年来在山东地区貉细小病毒也有相关报道。2016，于佳玉等[2]在泰安地区分离鉴定了3 株貉细小病毒，系统进化分析属于CPV-2 型；
2020 年，葛向平[3]在山东某貉养殖场分离到一株貉细小病毒，同样属于CPV-2 型。本研究通过实验室诊断，鉴定分离到一株貉源细小病毒，并为养殖场制定了针对性的防治措施，为貉源细小病毒的实验诊断与预防治疗提供参考。

在山东省泰安市某貉养殖场，患病貉出现精神沉郁，呕吐、腹泻等肠炎症状，剖检后观察到肠黏膜出血，肠系膜淋巴结出现水肿充血。根据患病貉的临床症状结合剖检病变，初步怀疑该病例为细小病毒感染，为进一步确定病原，需进一步进行实验室诊断。

2.1 病毒分离培养

采集患病貉的粪便加入总体积90%的生理盐水，制备成悬液。12000r/min 离心10min，取上清加入等体积的氯仿，再次12000r/min 离心10min，吸出氯仿既为病毒液。用0.22mm 滤器进行过滤除菌后按照同步接种的方式，以5%比例接种于CRFK 细胞中，培养72h，观察是否有病变，若无明显病变，将细胞冻融3 次后，从新接入生长良好的细胞中，按此方法盲传3 代后观察病变。F3 代培养48h 后细胞出现圆缩、拉丝、脱落等明显病变，如图1A 所示。而正常的对照细胞状态良好，如图1B 所示。

图1 CRFK 细胞病变情况

2.2 细胞半数感染量（TCID50）测定

取病变明显的F3 代细胞培养病毒液反复冻融3次，按照10 倍稀释法进行103～108稀释，将稀释好的病毒接种于CRFK 细胞96 孔培养板中，每孔加入0.1mL 病毒稀释液，每个稀释度重复8 个孔，放入CO2培养箱中培养72h，观察病变并记录有病变的孔数，按照ReedMuench 法进行TCID50 的计算。测得该细小病毒分离株的TCID50 为10～5.5/0.1mL。

2.3 猪红细胞凝集试验

在血凝板中加入25μL 的PBS，在第1 个孔中加入待测的病毒液，依次倍比稀释之第11 孔，弃去，第12 孔为阴性对照。在每个孔中加入1%的猪红细胞，震荡混匀后放置到4℃冰箱中，作用1h 后观察结果。结果显示该细小病毒分离株3～6 代病毒培养液的血凝效价基本稳定在28。

2.4 PCR 扩增试验

把病毒液煮沸5min，然后冰上放置5min 后以此为DNA 为模板进行PCR 扩增，反应体系为：10×PCR buffer：2.5μL；
dNTP：2μL；
上下游引物：0.5μ L；
rTaq：0.5μL；
加ddH2O 至25μL。反应条件如下：95℃预变性3min；
95℃变性30s；
55℃退火30s；
72℃延伸30s；
30 个循环后72℃延伸10min。取PCR 产物5μL 进行琼脂糖凝胶电泳。引物序列如下：F：5"-GCTACTCAGCCACCAACT-3"；
R：5"-TAAGCCCAATGCTCTATT-3"。经过PCR 扩增后凝胶电泳观察结果，如图2 所示，出现预期300bp 大小的特异性条带，结果表明，该分离毒株为貉细小病毒。

图2 PCR 扩增结果

2.5 间接免疫荧光试验

将生长状态良好的CRFK 细胞，消化传代后加入到6 孔细胞培养板中，每孔加入2mL，CO2培养箱中培养24h 后，每孔加入40μL F3 代病毒细胞培养液，作用3h 后使用预冷的PBS 洗涤细胞3 次，加入100μL 4%多聚甲醛（PFA）固定液，室温固 定15min，用PBS 洗涤残留的固定液后，用0.25%Triton X-100 处理细胞20min，PBS 洗去通透溶液，把抗CPV-2 型VP2 蛋白的一抗按照1∶400 比例稀释到PBS 溶液中，加入稀释好的一抗后放置4℃冰箱孵育过夜，用PBS 溶液洗涤细胞3 次，以去除多余的抗体。再使用TRITC 标记的二抗按照1∶500 比例稀释到PBS 溶液中，加入稀释好的二抗室温孵育1h。用PBS 洗涤去除残留的抗体。进行荧光显微镜下观察。如图3 所示：在接种F3 代病毒组可以观察到特异性绿色荧光，而正常的细胞对照组没有绿色荧光。

图3 间接免疫荧光结果

3.1 加强养殖场的饲养管理

对死亡的貉进行无害化处理，对养殖舍、笼具进行全面消杀；
把患病的貉隔离饲养。

3.2 紧急接种疫苗

对养殖场每只貉接种5mL 水貂肠炎灭活疫苗。

3.3 药物治疗

按照患病貉体重每日两次皮下注射盐酸吗啉4mL，阿托品2mL，庆大霉素5mL；
同时饲料中添加维生素C、益生菌辅助治疗。连续治疗5d 后，患病貉的病情得到有效控制。

貉作为细小病毒的易感动物，近几年在山东省、河北省等毛皮动物养殖大省，貉细小病毒病均有报道[2-5]，细小病毒已经成为威胁毛皮动物养殖业的主要病原之一。实验室分离鉴定，可以更加准确的鉴定病原，从而科学的指导临床治疗。目前防控貉细小病毒常用的疫苗主要有两种：一种是水貂肠炎灭活苗，另一种是水貂肠炎与水貂犬瘟热的二联疫苗。虽然水貂肠炎病毒与貉细小病毒具有很高的基因同源相似性，但在VP2 结构蛋白关键位点上有所不同，因此，研发有针对貉源细小病毒的疫苗非常有必要性。

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