不同养殖模式黄鳝胃肠道微生物群落结构分析

郑菲菲，单宇峰，祝东梅，杨禧文，陈 菲，叶 可，马 帅，王玉军

(华中农业大学水产学院，水产养殖国家级实验教学示范中心，武汉 430070)

黄鳝(Monopterusalbus)隶属于合鳃鱼科黄鳝属，常栖息于稻田、河流湖泊等淤泥质水底层，适应能力强。黄鳝味道鲜美、营养价值高，富含各种微量元素及不饱和脂肪酸等营养物质，作为滋补佳品深受人们喜爱，因而市场需求大幅增加，野生黄鳝已供不应求，目前多采用网箱进行高密度集约化养殖[1,2]。在集约化养殖过程中黄鳝会过量食用投喂的高蛋白、高脂肪饵料，但其消化能力较其它淡水肉食性鱼类弱，过量及不均衡的饮食会增加胃肠及肝胆的负担，加之高密度的养殖环境导致水质恶化快，极易引发黄鳝出血病、肠炎病、赤皮病、腐皮病等，甚至造成大量死亡，严重影响了黄鳝产业的健康发展[2,3]。

在长期进化过程中，鱼类与其胃肠道内的微生物间互惠双赢，形成了复杂的共生关系[4]。研究表明，不同养殖模式会对鱼类肠道微生物菌群产生影响。赵月季等[5]研究发现，4种养殖模式下凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)肠道微生物群落结构存在显著差异，而淡水池塘养殖模式肠道微生物菌群最稳定。此外，邱楚雯等[6]研究发现养殖模式能够通过改变水体中氮、磷的含量对水体和暗纹东方鲀(Takifuguobscures)肠道的微生物群结构产生一定的影响。盛鹏程等[7]发现投喂不同饲粮也会对乌鳢(Channaargus)肠道生物群落结构和微生物多样性产生影响，丁红秀等[8]研究发现4种不同生境来源的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肠道微生物组成和群落特征随着养殖水体的饵料和环境因子的变化而产生较大差异。另外，鱼类肠道不同区段的生理生化环境也会对相应区段微生物菌群产生影响[9]。但是，目前关于不同养殖模式下黄鳝肠道微生物的差异仍未有系统研究。

目前，黄鳝多以网箱养殖为主，主要分为投喂鱼浆与投喂水蚯蚓，以及与虾蟹混放散养等养殖模式。究竟哪种养殖模式更有益于黄鳝肠道菌群值得探究。因此，本实验通过高通量测序的方法，对虾塘散养、蟹塘散养、网箱投喂鱼浆及网箱投喂水蚯蚓4种养殖模式下黄鳝胃及肠道的微生物进行检测，分析比对不同养殖模式黄鳝胃及肠道微生物菌群的异同，探究不同养殖模式对黄鳝胃及肠道微生物菌群的影响，以期为黄鳝的健康养殖提供一定的理论依据。

1.1 样品采集

4种不同养殖模式黄鳝采取自仙桃市西流河镇，每种养殖模式随机选取9尾，体重约为(117.75±31.77) g。用MS222麻醉后，用75%酒精擦拭黄鳝体表消毒，迅速在BSC-1300型无菌操作台内解剖，分别取胃和肠道[10]，每3尾黄鳝的相同位置的部分组织放入一个2 mL冻存管中混为一个样本，每种养殖模式取3个混合样本。样品取好后迅速放于液氮中冻存备用。虾塘散养组、蟹塘散养组、网箱投喂鱼浆组和网箱投喂水蚯蚓组的黄鳝样品编号分别为：A、B、C和D；
胃编号为X，肠道编号为Y。

1.2 DNA提取和PCR扩增

用DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek公司，美国)提取黄鳝胃、肠微生物总DNA，用Nanodrop NC2000定量DNA，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

两步建库法：第一步以DNA为模板，设计带接头的引物进行PCR，第二步以第一步的PCR产物为模板在9902型96 well PCR仪进行PCR。用16S rRNA V3-4区通用引物(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′,806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行目标区域PCR扩增；
扩增体系(30 μL)：基因组DNA 50 ng±20%、338F(10 μmol/L) 0.9 μL、806R(10 μmol/L) 0.9 μL、KOD FX Neo Buffer 15 μL、dNTP(2 mmol/L each) 6 μL、KOD FX Neo(NEB公司，美国) 0.6μL、ddH2O补至30 μL；
PCR程序：98 ℃ 2 min；
98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；
72 ℃ 5 min，4 ℃直到停止。Solexa PCR(20 μL体系)：目的区域PCR纯化产物5 μL、2 μmol/L MPPI-a 2.5 μL、2μmol/L MPPI-b 2.5 μL、2×Q5 HF MM 10 μL，反应条件：98 ℃ 30 s；
98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；
72 ℃ 30 s；
72 ℃ 5 min；
1.8%的琼脂糖凝胶，DYY-6C型电泳仪电压为120 V，电泳40 min；
将PCR产物根据电泳定量结果，按照质量比1∶1进行混样；
混样后，采用OMEGA DNA纯化柱(Monarch公司，美国)进行过柱纯化；
1.8%的琼脂糖凝胶，120 V 40 min电泳后，切目的片段并回收；
构建好的文库在武汉擎科生物技术有限公司用illumina Novaseq6000 PE250进行高通量测序。

1.3 测序数据分析

用Trimmomatic v0.33软件对测序得到的原始序列进行过滤，然后使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量序列，使用QIIME2 2020.6软件中的DADA2方法进行去噪并去除嵌合体序列，得到最终有效序列；
利用USEARCH version 10.0软件在相似性97%的水平上对序列进行可操作分类单元(operational taxonomic unit,OUT)分析；
再利用R语言工具绘制稀释性曲线图、等级丰度曲线图、Venn图、群落结构图和热图；
使用QIIME2软件对样品Alpha多样性指数进行评估，分析样品间物种多样性。

2.1 样品测序质量分析

基于Illumina Novaseq测序及数据预处理总共获得3 689 315条有效序列；
以97%相似性水平为标准划分各样品的OTU数量。利用已测得的rDNA序列中已知的各OTU相对比例与其相对应的OTU数量的期望值来构建稀释性曲线，各样品曲线都达到平台期(图1)，等级丰度曲线反映出4组黄鳝胃肠道内物种分布均匀(图2)。综上所述，说明随着测序深度的增加测序量达到饱和且测序质量比较好、数据量合理，测序的深度基本能够覆盖不同养殖模式黄鳝胃肠道微生物的所有物种。

图1 不同养殖模式样品高通量测序结果的稀释曲线Fig.1 The rarefaction curve of high-through sequencing result of samples from different culture modes

2.2 胃肠道微生物Alpha多样性分析

根据4种养殖模式中黄鳝胃肠道微生物OTU数量，进行Alpha指数分析。通过覆盖率来评估抽样的完整性，本研究中各样品OTUs的覆盖率是99.95%～100%，说明各样品中的全部微生物种类几乎都被检测到(表1)。OTU、Chao1和ACE表征丰富度，数值越高，表明群落的总数越高即丰富度越高；
Shannon和Simpson指数表征物种多样性，数值越高，表明群落的多样性越高。

图2 等级丰度曲线图Fig.2 Curves of rank abundance

4种养殖模式胃的OTU、Chao1和ACE指数表明，网箱投喂水蚯蚓组和虾塘散养组菌落丰富度都较高，网箱投喂鱼浆组次之，蟹塘散养组丰富度最低；
胃的Shannon和Simpson指数表明网箱投喂鱼浆组的物种多样性最高，其次是网箱投喂水蚯蚓组和虾塘散养组，物种多样性最低的是蟹塘散养组。

4种养殖模式肠道的OTU、Chao1和ACE指数表明，网箱投喂鱼浆组和网箱投喂水蚯蚓组的黄鳝菌落丰度都较高，蟹塘散养组次之，虾塘散养组丰富度最低；
肠道的Shannon和Simpson指数表明网箱投喂水蚯蚓组的物种多样性最高，其次是网箱投喂鱼浆组和虾塘散养组，物种多样性最低的是蟹塘散养组。

表1 不同养殖模式黄鳝胃肠道微生物Alpha多样性分析Tab.1 Alpha-diversity of stomach and intestines microbial community of M.albus in different culture modes

2.3 Venn图分析

为分析4种不同养殖模式胃肠道样品中共有和独有的OTU的数目，根据样本的OTU绘制Venn图。如图3所示，虾塘散养组、蟹塘散养组、网箱投喂鱼浆组和网箱投喂水蚯蚓组胃的OTU数分别为474、337、392和470个，共有的OTU数量为152个，特有的OTU数量分别为89、30、43和103个，分别占各自所有OTU总数的18.78%、8.90%、10.97%和21.91%。4种养殖模式肠道的OTU数量分别为308、389、478和458个，共有的OTU数量为143个，特有的OTU数量分别为49、50、86和83个，分别占各自所有OTU总数的15.91%、12.85%、17.99%和18.12%。

图3 不同养殖模式样品OTU分布Venn图Fig.3 OTU Venn analysis of samples from different culture modes

2.4 肠道微生物群落结构和组成分析

样品中所有OUT经物种注释，在门和属的水平分析不同组别的优势菌种。图4为门水平上微生物的相对丰度，4种养殖模式下黄鳝的胃肠道微生物主要由厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和疣微菌门组成，但优势菌群存在一定差异。不同养殖模式黄鳝消化道的不同区段优势菌群也不同，4种养殖模式下黄鳝胃的最主要优势菌均是厚壁菌门，变形菌门在虾塘散养、蟹塘散养和网箱投喂鱼浆养殖环境下也较多，疣微菌门只在网箱投喂鱼浆及网箱投喂水蚯蚓养殖环境下占优势，拟杆菌门只在网箱投喂水蚯蚓养殖环境下占有优势。除蟹塘散养外，其余3种养殖模式黄鳝肠道的优势菌均为厚壁菌门，蟹塘散养养殖模式中黄鳝肠道的优势菌为变形菌门。

图4 门水平上微生物相对丰度Fig.4 Microbial community structure of different samples in phylum

图5为属水平上微生物的相对丰度，4种养殖模式黄鳝消化道优势菌群均差异明显。就黄鳝胃而言，虾塘散养和网箱投喂鱼浆组的优势菌群为韦荣球菌属(Veillonella)，分别占细菌总数的51.81%、38.53%；
蟹塘散养组优势菌群为韦荣球菌属和绿脓杆菌属(Pseudomonas)，分别占细菌总数的25.46%、27.22%；
网箱投喂水蚯蚓组的优势菌群为粪杆菌属(Faecalibacterium)与嗜黏蛋白阿克曼菌属(Akkermansia)，分别占细菌总数的22.13%、15.53%。综上所述，除网箱投喂水蚯蚓组外，其余3种养殖模式中黄鳝胃的优势菌群都有韦荣球菌属。就黄鳝肠道而言，除虾塘散养组的优势菌为瘤胃球菌属(Ruminococcus)，占细菌总数的26.56%，其余3种养殖模式的优势菌群中都有双歧杆菌属。其中蟹塘散养组的优势菌为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)，分别占细菌总数的25.70%和23.58%；
网箱投喂鱼浆组的优势菌为双歧杆菌属，占细菌总数的24.63%；
网箱投喂水蚯蚓组的优势菌为双歧杆菌属和流感嗜血杆菌属(Haemophilus)，分别占细菌总数的13.28%、14.99%。

图5 属水平上微生物相对丰度Fig.5 Microbial community structure of different samples in the genus

2.5 肠道微生物群落相对丰度

对黄鳝胃肠道微生物在属水平上进行聚类式热图分析，由图6可看出，4种养殖模式下黄鳝胃肠道微生物主要聚为两大分支，多数胃样品聚为一支，多数肠道样品聚为一支。

就黄鳝胃而言，虾塘散养组中的韦荣球菌属丰度显著高于其它组；
蟹塘散养组中绿脓杆菌属和柯林斯菌属(Collinsella)丰度显著高于其它组；
网箱投喂鱼浆组中霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、韦荣球菌属、疣微菌属等丰度显著高于其它组；
网箱投喂水蚯蚓组中丰度较高的菌群有粪杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属、拟杆菌属(Bacteroides)和另枝菌属(Alistipes)等。

就黄鳝肠道而言，虾塘散养组中瘤胃球菌属、毛螺菌科的丰度显著高于其它组；
蟹塘散养组中丰度显著较高的为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、双歧杆菌属和埃希氏菌属(Escherichia)；
罗氏菌属(Roseburia)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)和双歧杆菌属等在网箱投喂鱼浆组中丰度显著较高；
网箱投喂水蚯蚓组中流感嗜血杆菌属、罕见小球菌属(Subdoligranulum)等丰度较高。

图6 微生物群落在属水平的热图分析Fig.6 Microbial community heatmap analysis of different samples in genus

综上所述，蟹塘散养组胃肠道微生物物种多样性和丰度均最低，而网箱投喂水蚯蚓组黄鳝胃肠道微生物多样性和丰度都较高。研究表明，肠道微生物多样性与机体的健康密切相关，肠道微生物多样性的降低可能会成为多种疾病的诱因，例如炎症性肠病等[11]。朱昊俊等[12]也发现，黄颡鱼肠道微生物多样性更高，稳定性更好，对疾病的抵抗力可能更强。但肠道菌群是否健康不仅和肠道微生物多样性相关，还和优势菌群关系密切。比如，饲喂畜禽内脏饲料的乌鳢肠道细菌群落多样性比饲喂冰鲜鱼组的高，但是其存在潜在致病菌，从乌鳢肠道微生物健康角度考虑，冰鲜鱼较畜禽内脏更适合作为乌鳢的饲粮[7]。

分析发现4种养殖模式下黄鳝胃肠道微生物主要由厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和疣微菌门组成。研究表明，异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)和斑马鱼(Daniorerio)肠道都有核心菌群[13,14]，本研究发现除蟹塘散养组黄鳝肠道的优势菌为变形菌门，其余3种养殖模式黄鳝胃肠道优势菌群均为厚壁菌门。推测不同养殖模式对菌群种类影响不大，只是影响各菌群所占比例；
黄鳝胃肠道微生物的核心菌群可能是厚壁菌门。朱昊俊等[12]研究发现，厚壁菌门丰度的提高有利于从相同饮食中获取更多能量。并且有研究报道指出，变形菌门丰度的增高可能是肠道菌群失衡的一个重要标志[15]。

通过分析研究结果发现虾塘散养组、蟹塘散养组和网箱投喂鱼浆组养殖模式中黄鳝胃的优势菌种均为韦荣球菌属。研究发现韦荣球菌产生的内毒素会引发慢性炎症，诱导细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的释放[16]；
ZHAO等[17]发现长期食用高脂肪、低纤维的食物会导致肠道菌群失调，尤其是革兰氏阴性菌增多，从而产生过多的内毒素引发炎症反应，并造成肥胖、糖尿病等慢性病的发生，推测虾塘散养、蟹塘散养与网箱鱼浆养殖模式存在较高的潜在患病风险，并且黄鳝由于贪食高脂肪、高蛋白饵料，养殖过程中经常暴发的肠炎病可能与韦荣球菌相关。网箱投喂水蚯蚓组养殖模式中黄鳝胃中粪杆菌属和嗜黏蛋白阿克曼菌属占比最多。粪杆菌在人肠道中分布广泛，是健康的标志，并有研究表明粪杆菌属的普拉梭菌在肠道黏膜屏障保护及炎症抑制等方面发挥重要作用，在益生菌开发或生物治疗药物方面前景光明[18,19]；
嗜黏蛋白阿克曼菌也是肠道菌群中的“明星菌”，在抗衰老、抗肿瘤、机体代谢、免疫调节等方面发挥重要作用[20]。虾塘散养组黄鳝肠道的优势菌群为瘤胃球菌属，这可能与虾塘散养组黄鳝捕食小龙虾有一定的关系；
其它三种养殖模式黄鳝肠道的优势菌群均为双歧杆菌，双歧杆菌在促进肠道健康、延缓衰老、提高机体免疫、降血糖、降血脂和降胆固醇等方面发挥功效[21]。黄鳝肠道优势菌群的差异也印证了前人的研究，鱼类摄食不同类型的食物会影响肠道微生物菌群[8]。并且黄鳝胃和肠道中的优势菌群存在差异，可能是由于其胃和肠道的组织结构、消化酶活力等不同有关，胃的蛋白酶和淀粉酶活力高，有较强的消化能力但没有吸收细胞分布，而肠道的吸收能力则较强[10,22]。

水蚯蚓是一种优质的开口饵料，研究发现其体内含有抑菌活性物质[23]，饲料中添加抗菌肽可以调节黄鳝肠道菌群结构，提高菌群多样性[24]。并且，江为民等[25]发现用水蚯蚓搭配少量配合饲料在网箱中养殖黄鳝成活率高，品质好，经济效益高。

综合比较发现，网箱投喂水蚯蚓组黄鳝消化道微生物丰度和多样性都较高，胃肠道益生菌群占比高，潜在的致病菌少；
而网箱投喂鱼浆的养殖模式虽然黄鳝生长较快，但是鱼浆对水质污染严重易导致疾病大爆发，并且胃肠道潜在的致病菌较多，养殖风险高。因此，在养殖黄鳝时，推荐使用网箱养殖并适当调整养殖密度，水蚯蚓作为开口饵料或育肥饵料，养殖过程中则按照一定比例添加鱼浆与配合饲料以降低成本。

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