武文豪，李开杰，王 庆，李丹丹,3，王华磊,3，李金玲,3，罗春丽,3
（1.贵州大学农学院 贵州，贵阳 550025;2.乌当区农业科技园区建设服务中心 贵州，贵阳 550018;3.贵州省药用植物繁育与种植重点实验室 贵州，贵阳 550025）
草珊瑚又名肿节风，属金粟兰科（Chloranthaceae）植物草珊瑚（Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai）干燥全草，具有清热凉血，活血消斑，祛风通络的功效，主治血热发斑发疹，风湿痹痛，跌打损伤等症[1]。研究发现在草珊瑚中主要含有黄酮类、萜类、酚酸类、香豆素类、挥发油类等活性成分[2]。药理学研究表明草珊瑚具有抗菌、消炎、抗肿瘤、抗病毒及促进骨折愈合等作用[3-6]。
药用植物抑菌已成为抑菌药物开发的热点方向，研究表明大部分清热解毒药用植物具有显著而广谱的抑菌活性，为筛选天然抑菌药物指明了方向[7]。刘洋等[8]提出川白芷不同溶剂萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌以及肺炎克雷伯氏菌等均有一定抑菌活性。荣茜等[9]的研究表明黄连、青果、金银花、金果榄对猪源幽门螺旋杆菌均有很强的体外抑菌活性。此外，知母[10]、大蒜[11]、丹参[12]、五味子[13]等天然药物的抑菌作用研究也均有报道。贵州地区草珊瑚资源丰富，仅贵州省榕江县就有5000亩以上天然草珊瑚抚育林，开展草珊瑚抑菌活性研究，对促进黔产草珊瑚进一步开发利用、促进黔草珊瑚产业可持续高质量发展具有重要意义。
1.1.1 试验原料 本试验中使的用草珊瑚为2020年采收于贵州省榕江县水尾乡（25°71′N，108°20′E），经贵州大学农学院李丹丹老师鉴定该草珊瑚属于金粟兰科（Chloranthaceae）植物草珊瑚（Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai）。草珊瑚采收后将其清洗干净，45℃烘干至恒重，粉样，过3号筛，备用。
1.1.2 供试菌种及培养基 真菌：小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum schw）、炭疽病菌（Melanconium magnum）、烟草赤霉病菌（Alternariaalternate(Fries)Keisslar）、白术根腐病菌（Fusariμm oxysporμm Schlecht）、须癣毛癣菌（trichophyton mentagrophytes）、红色毛癣菌（trichophytonrubrum）。
细菌：大肠杆菌(Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。
培养基：PDA固体培养基（真菌用）、LB固体培养基（细菌用）、LB液体培养基。
1.1.3 试验仪器与试剂 101-3AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），超净工作台（苏州净化仪器有限公司），高压灭菌锅（厦门致微仪器有限公司），FW-100型粉样机（北京市永光明医疗仪器有限公司），RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），CP224S型电子分析天平（德国赛多利斯公司），2.5%凯松试剂（山东磊林商贸有限公司），石油醚（30℃～60℃），乙酸乙酯，正丁醇均为分析纯（ABCAM公司），试验所用涂布器，镊子，打孔器，三角瓶，培养基等器材均在121℃的湿热环境下灭菌备用。无菌水：由蒸馏水经高压灭菌锅121℃下灭菌20min制得。0.1%凯松溶液[14]：由2.5%凯松杀菌防腐剂稀释制得。
1.2.1 样品溶液的制备 采用回流提取法，称取草珊瑚干燥粉末样品50g于1000mL圆底烧瓶中，加入500mL蒸馏水回流提取2h，重复提取3次，合并滤液，在其冷却后过滤，所得滤液取400mL依次使用石油醚（30℃～60℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得萃取液使用旋转蒸发仪分别旋至浸膏状，4℃低温保存所得浸膏。剩余滤液取一小部分保存，留待做草珊瑚粗提液抑菌初筛使用，剩余部分同样旋干至浸膏状保存。
1.2.2 菌种活化及菌悬液制备 分别取白术根腐病菌、小麦赤霉病菌、红色毛癣菌、炭疽病菌、烟草赤霉病菌、须癣毛癣菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的菌种，采用划线法将各菌种接入已经准备好的PDA固体培养基（真菌）或LB固体培养基（细菌）上，细菌37℃，真菌28℃下培养24h。取活化后的真菌或细菌，挑取部分菌丝或菌斑，接种到含有适量LB液体培养基的试管中，振荡培养24小时，获得各种真菌和细菌的菌悬液。
1.2.3 草珊瑚提取物抑菌初筛 取上述活化好的菌悬液50μL于制备好的PDA固体培养基（真菌）或LB固体培养基（细菌）中，用涂膜棒均匀涂布平板表面，使用打孔器在平板上打直径6mm的孔，去除培养基块，向孔内注入草珊瑚水取物，每孔30μL，以0.1%凯松试剂为阳性对照，无菌水为阴性对照，每个处理设置3次重复。真菌28℃，细菌37℃下培养24h，观察有无抑菌圈，并测定抑菌圈大小，取其平均值。
1.2.4 草珊瑚不同提取物抑菌活性 试验中得到的石油醚萃取物极少，在抑菌活性研究中没有对其进行考察。使用二倍稀释法，将上述所得浸膏配制500mg/mL、250mg/mL、100mg/mL、75mg/mL、50 mg/mL浓度梯度的溶液，抑菌方法参照1.2.3节，将不同浓度提取液注入已打孔的培养基内，每个处理设置三个重复，真菌28℃，细菌37℃下培养24h，测量抑菌圈大小，取其平均值。以凯松溶液作为阳性对照。
1.2.5 不同萃取物最小抑菌浓度 依据1.2.4节不同萃取物抑菌活性结果，将各萃取物配制成浓度梯度为20mg/mL、15mg/mL、10mg/mL、5mg/mL的药液进行抑菌试验。抑菌方法参照1.2.3节。
利用Excel2019对原始数据进行处理分析，采用SPASS20进行数据标准误差分析。
试验采用平板打孔法分别考察了草珊瑚水粗提取物对白术根腐病菌、小麦赤霉病菌、红色毛癣菌、炭疽病菌、烟草赤霉病菌、须癣毛癣菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，经过抑菌初步筛查（见表1），结果发现，草珊瑚水粗提取物对小麦赤霉病菌、炭疽病菌、白术根腐病菌、红色毛癣菌不能形成抑菌圈，无抑制作用，而对烟草赤霉病菌、须癣毛癣菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌4种菌株有抑菌效果，能形成明显的抑菌圈，其中草珊瑚水提物对须癣毛癣菌和大肠杆菌的抑菌圈直径高于另外金黄色葡萄球菌和烟草赤霉病菌。
表1 草珊瑚水提物的抑菌圈直径
在草珊瑚不同提取物的抑菌活性的试验中，从表2中可以看出，草珊瑚水提取物和三种萃取物对四种受试菌种表现出不同程度的抗菌效果，通过抑菌圈直径可判断草珊瑚不同提取物抑菌活性强弱。其中草珊瑚正丁醇提取物（BE）的抗菌活性最强，水萃取物（SE）的抗菌活性最弱。草珊瑚不同提取物对四种受试菌种的最小抑菌浓度由表2可见，其中草珊瑚提取物对须癣毛癣菌的最小抑菌浓度为水提物（AE）＞50 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）＜50 mg/mL，水萃取物（SE）＞100 mg/mL；
对大肠杆菌的最小抑菌浓度为水提物（AE）=正丁醇萃取物（BE）＜50 mg/mL，水萃取物（SE）＞100 mg/mL；
对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为水提物（AE）=正丁醇萃取物（BE）＜50 mg/mL，水萃取物（SE）＞100 mg/mL；
对烟草赤霉病菌的最小抑菌浓度为水提物＞50 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）＜50 mg/mL，水萃取物（SE）＞75 mg/mL。
表2 草珊瑚水提液不同萃取物抑菌活性结果
结合表2和表3可以得出草珊瑚不同萃取物对大肠杆菌、须癣毛癣菌、金黄色葡萄球菌以及烟草赤霉病菌的最小抑菌浓度。对须癣毛癣菌的最小抑菌浓度为水提物（AE）=75 mg/mL，乙酸乙酯萃取物（EAE）=20 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）=15 mg/mL，水萃取物（SE）=250 mg/mL；
对大肠杆菌的最小抑菌浓度为水提物（AE）=50 mg/mL，乙酸乙酯萃取物（EAE）=15 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）=10 mg/mL，水萃取物（SE）=125 mg/mL；
对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为水提物（AE）=50 mg/mL，乙酸乙酯萃取物（EAE）=正丁醇萃取物（BE）=15 mg/mL，水萃取物（SE）=250 mg/mL；
对烟草赤霉病菌的最小抑菌浓度为水提物（AE）=75 mg/mL，乙酸乙酯萃取物（EAE）=15 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）=20 mg/mL，水萃取物（SE）=100 mg/mL。结合各类萃取物对四种菌株的最小抑菌浓度综合分析，四种供试物质的抑菌活性大小为草珊瑚正丁醇萃取物（BE）＞草珊瑚乙酸乙酯萃取物(EAE)＞草珊瑚水提物(AE)＞草珊瑚水萃取物(SE)。
表3 正丁醇及乙酸乙酯萃取物的最小抑菌浓度
面对感染性疾病，由于滥用抗生素，致病菌的耐药性问题日益严峻，甚至已经造成了一些不良反应。如长期服用抗生素导致菌群失调和各种不良反应，出现了恶心、呕吐等胃肠道反应及过敏反应。在试验选用的几类菌种中，大肠杆菌是革兰阴性菌的典型代表，多存在于人和动物的肠道内，在一定条件下会引起多种疾病。金黄色葡萄球菌则为革兰氏阳性菌的典型，在自然环境中广泛分布，对人体的感染率仅次于大肠杆菌。须癣毛癣菌在我国新疆少数民族地区多见，是会引起人皮肤癣的一类感染性真菌。在面对这些菌种所引起的各类疾病中，抗生素已经难以成为最优的选择。人们的目光逐渐转向非抗生素途径，药用植物作为其中的一种，已经成为当前的研究热点。小麦赤霉病菌、白术根腐病菌、炭疽病等病菌则为植物类病害的常见致病菌，在种植过程中，各类作物经常由于感染这类病菌而导致产量或品质下降等问题。在应对这些致病病害时，目前多采用化学防治，即选用各种农药进行防治，而农药开发多注重高效、低残留，天然药用植物抑菌的低毒特性也使其成为农药开发领域的一个重要方向。
草珊瑚是我国的传统中药，具有清热解毒、祛风活血、消肿止痛、抗菌消炎等作用。它具有广谱抗菌作用，对痢疾杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌等均有抑菌作用[15]，但是否对须癣毛癣菌、烟草赤霉病菌的等菌种具有抑制作用尚未报道。本试验采用平板打孔法检测了8种菌种对黔草珊瑚不同萃取物浸膏的敏感性，结果表明黔草珊瑚水提物确对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、须癣毛癣菌和烟草赤霉病菌四种致病菌具有抑制作用，其中乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌效果要远大于水提物及水萃取物，其最小抑菌浓度均在10～15 mg/mL。这为黔草珊瑚用于开发预防治疗大肠杆菌等三种菌株所引起的疾病提供了依据。另外本试验发现黔草珊瑚对烟草赤霉病菌也具有一定程度的抑制作用。烟草赤霉病作为烟草常见病的一种，对于烟草产量及品质均具有较大影响，试验发现黔草珊瑚对于烟草赤霉病菌具有抑制作用，此发现对于黔草珊瑚开发烟草病害生物防治农药具有一定借鉴意义。
在水提物与三种萃取物的抑菌活性比较中，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌活性均要高于水提物及水萃取物，可能原因为在乙酸乙酯与正丁醇的萃取过程中，草珊瑚的抑菌物质被较大限度的萃取出来。有研究表明从草珊瑚提取物中分离得到的化合物之中，倍半萜对金黄色葡萄球菌的抑菌效果达到64.5%[16]；
香豆素类的异秦皮啶也具有较好的抑菌作用[17]。草珊瑚的乙酸乙酯和正丁醇部位化学成分研究中发现，倍半萜类化合物是草珊瑚乙酸乙酯部位的主要化学成分[18]，正丁醇部位的化合物最主要是香豆素类[19]，这些研究解释了在草珊瑚水提液中乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物研究效果较好的原因，但对于在乙酸乙酯萃取物与正丁醇萃取物中究竟是何种化学成分发挥抑菌作用还较为模糊，可以作为进一步的研究方向。
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